拟南芥m60突变体的表型分析、基因克隆及基本功能预测

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核糖体生物合成是细胞中最基本的生物学过程之一,真核生物的核糖体是由47种结构蛋白和23S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA构成的60S亚基以及另外32种结构蛋白和18S rRNA构成的40S亚基所组成。rRNA的缺失会使得核糖体不能有效地行使翻译蛋白质的功能,从而导致一些代谢途径不能正常进行,生长发育过程即会表现出一系列的缺陷表型。本实验选用拟南芥(Arabidopsis thaliana)m60突变体植株为实验对象,逐步分析突变体表型继而对基因M60做功能预测分析。突变体m60植株较野生型有明显表型:植株生长矮小,腋芽发育生长旺盛,有性生殖发育过程迟缓;叶片形态发育异常,表现为叶面小,叶缘缺刻明显;主根生长迟缓,侧根发生明显增多,通过进一步的观察,我们发现突变体m60根尖的细胞数目明显少于野生型。经I-PCR的方法,确定该突变体中T-DNA单拷贝插入在基因M60第二个内含子上,经NCBI比对其CDS序列后,发现其是一个DEAD-boxRNA解旋酶编码基因。我们克隆出该基因的启动子区并连接报告基因构建表达载体,并结合qRT-PCR检测分析的结果,发现该基因在根和叶中都有大量表达。克隆该基因自身启动子连接基因全长构建回复载体,转基因之后能够完全回复缺陷表型,证实这些缺陷表型确实是该基因的突变所导致。真核生物的核糖体生物合成及其调控机制在芽殖酵母中的研究比较清楚,而高等植物中的相关研究却非常有限。拟南芥M60基因在酵母中同源基因是核仁定位,通过影响pre-rRNA的剪切成熟来影响核糖体60s大亚基的形成,这恰好也启示我们M60基因在拟南芥中也与核糖体发生过程相关。核糖体是细胞内蛋白合成的分子机器,既然拟南芥M60基因影响核糖体的发生,那势必会影响细胞内蛋白质的翻译水平,进而可能引起这一系列的表型。通过观测m60突变体表型,推测该基因可能与生长有关的代谢生理途径有关,所以这也为我们下一步寻找可能被影响到的下游基因奠定了重要的基础。
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