论文部分内容阅读
目的:筛查并确证碳青霉烯异质性耐药大肠埃希菌(Carbpenem-Heteroresistant Escherichia coli,CHEC),探究异质性耐药的分子机制;评估六种碳青霉烯酶表型方法的检测效果。方法:收集我院2011年6月至2015年12月无菌体液中分离的大肠埃希菌532株,使用纸片扩散法(Kirby-Bauer disk diffusion test,K-B test)筛检CHEC菌株,菌落谱型分析(Population Analysis Profile,PAP)实验进一步证实CHEC菌株,微量肉汤稀释法检测CHEC菌株对亚胺培南的MIC值;PCR及测序方法检测CHEC菌株碳青霉烯酶基因、超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases,ESBLs)基因、膜孔蛋白(Outer membrane proteins,OMPs)基因和青霉素结合蛋白2(penicillin-binding protein 2,PBP2)基因mrd A;体外IPM诱导实验验证异质性耐药的进展过程;RT-q PCR方法检测原代及各诱导亚群ESBLs和膜孔蛋白的表达水平;改良霍金实验(MHT)、Triton Hodge实验(THT)、Carba NP实验(CNPt)、simplified Carba NP实验(CNPt-direct)、Blue-Carba NP实验(BCT)和碳青霉烯灭活实验(CIM)检测256株碳青霉烯耐药革兰阴性菌产酶情况,麦克尼马尔试验对六种表型方法进行方法学评估。结果:1.2011-2015年,K-B法筛选出IPM异质性耐药菌株分别为41株(68.33%)、41株(34.17%)、37株(32.17%)、70株(59.32%)和84株(70.58%);ETP异质性耐药菌株分别为31株(51.67%)、29株(24.17%)、17株(14.78%)、30株(25.42%)和56株(47.58%);MEM异质性耐药菌株分别为2株(3.33%)、8株(6.67%)、4株(3.48%)、12株(10.17%)和8株(6.72%);PAP实验证实36株表型异质性耐药菌株均为异质性耐药菌株。2.耐药基因检测结果显示,36株CHEC菌株中共检出bla CTX-M 33株(91.67%)和bla TEM 12株(33.3%)。其中10株(27.8%)联合表达bla CTX-M和bla TEM;仅一株omp C基因缺失;未检测到碳青霉烯酶基因。3.体外IPM诱导实验结果显示,长时间低浓度抗生素诱导条件下,随着诱导亚群的MIC值升高,PAP曲线右移,说明异质性耐药是进化至碳青霉烯耐药的中间阶段。4.RT-q PCR结果显示,随着诱导亚群MIC值的增高,bla TEM-1表达显著上调,膜孔蛋白表达显著下调,P值有统计学差异。5.PCR及测序方法检出256株碳青霉烯耐药菌株中产碳青霉烯酶139株,非产碳青霉烯酶菌株117株。MHT、THT、CNPt、CNPt-direct、BCT和CIM分别检出产酶菌株105株(75.5%)、118株(84.9%)、92株(66.2%)、129株(92.8%)、114株(82.0%)和130(93.5%)。CNPt-direct和CIM的灵敏度均高于MHT、CNPt和BCT,有统计学差异(P<0.003);CNPt-direct和CIM比较,灵敏度无统计学差异(92.8%vs93.5%,P=1);THT的特异度(91.5%)低于CNPt,CNPt-direct,BCT和CIM特异度(100%),有统计学差异(P<0.003)。结论:1.无菌体液中分离的大肠埃希菌存在普遍的碳青霉烯异质性耐药现象,近三年CHEC菌株对IPM和ETP异质性耐药率呈上升趋势,对MEM异质性耐药率较低较稳定。2.体外IPM诱导实验证实碳青霉烯异质性耐药是大肠埃希菌由敏感进展至碳青霉烯耐药的中间阶段。3.bla TEM-1表达上调联合膜孔蛋白表达下调可能是我院CHEC菌株进展至耐药的主要机制。4.CNPt-direct和CIM特异度和灵敏度高,操作简单,能够快速检测碳青霉烯酶,具有重要的临床实用价值。