解脂亚罗酵母CRISPR-iCas9高效基因编辑体系及玉米黄质合成菌株构建

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近年来,利用微生物代谢生产目标化合物已广泛受到关注,可以通过基因编辑技术改造微生物,将廉价的碳、氮源转化为各种高附加值产品。玉米黄质是一种脂溶性萜烯化合物,具有许多生物效应,如抑制肿瘤细胞和防止白内障,由于人体无法合成,必须通过食物补充获得。因此,玉米黄质在食品、保健品领域受到了广泛的关注。解脂亚罗酵母是国际公认的安全酵母菌株,该菌株进行遗传改造后已经被广泛用于脂肪酸衍生的生物燃料和化学品的生产。然而,目前运用CRISPR-Cas9技术对解脂亚罗酵母进行基因改造时,面临操作低效率、低通量的问题,所以需要对该系统进行优化,从而提高基因敲除和整合效率。对此,本研究在解脂亚罗酵母中建立了高效CRISPR-iCas9技术,可以快速实现无意义基因的敲除和目的基因的整合,达到高效率、高通量的基因编辑效果,并将其运用在解脂亚罗酵母中外源合成玉米黄质的通路构建上,整合玉米黄质合成关键基因以提高目标产物产量。具体的研究结果如下:(1)针对REC1识别区域的两个氨基酸进行定点突变,分别为D147Y和P411T,从而优化Cas9蛋白结构域,建立CRISPR-iCas9系统。该系统的建立使得单个基因敲除效率高达100%,mfe1、gut2、pox3和pex10四个基因同时敲除效率可达80%,表明CRISPR-iCas9系统具有高效敲除普遍适用性。但由于非同源末端修复的敲除导致突变菌株基因序列差异巨大,所以设计双质粒指导敲除系统对gut2和pox3进行敲除,测序结果表明敲除后按照Donor DNA序列修复,其中包括sgRNA和PAM序列在内的23 bp缺失,达到指导型敲除结果,并且效率高达100%。(2)利用建立的CRISPR-iCas9技术一步多基因整合β-胡萝卜素合成关键基因carRA/carB/GGS1/tHMG,成功构建了 β-胡萝卜素积累菌株YL-ABTG,对该菌株进行摇瓶发酵,结果表明,菌株生长状态良好,稳定性强,最终β-胡萝卜素产量可以达到3.12mg/g DCW。(3)利用CRISPR-iCas9技术成功构建了玉米黄质生物合成通路,将β-胡萝卜素转化为高附加值产品玉米黄质,并通过过表达β-胡萝卜素-3-羟化基因(CrtZ)以促进玉米黄质的生物合成,使得玉米黄质产量可达2.33mg/g DCW。综上,本研究建立的CRISPR-iCas9系统可以极大缩短基因改造的时间,可以快速实现无意义基因的敲除,且此技术可以整合大片段目的基因至染色体,实现快速一步多基因整合。因此,CRISPR-iCas9技术对解脂亚罗酵母菌株进行高效的遗传改造提供了可行的方案,并为提高生物化合物的产量,获得更高的商业价值提供了有效支持。
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