常染色体显性遗传夜发性额叶癫痫(autosomal dominant noctumal frontal lobe epilepsy, ADNFLE)是一种特发性局灶性癫痫综合症,多在睡眠时发作,为一种常染色体显性单基因遗传病。起病年龄从2个月～52岁,其中大多数为儿童,一般表现为儿童期起病,症状持续至成人期,男女发病率相似。发作多与睡眠关系密切,常表现为睡眠时出现手足痉挛、抽动以及呼喊、尖叫等症状,其临床特征为夜发性、丛集性、短暂性的运动,常被误认为睡眠障碍等非痫性发作。ADNFLE在大多数已知家系的遗传外显率约为70%-80%,偶可见于散发病例,一般依据临床特点诊断,辅助检查缺乏特异性指标,发作间期脑电图可正常,头颅CT、MRI也未发现特征性的脑结构异常。散发病例及家系病例临床特征和脑电图特征相似,但各病例间临床表现的复杂性和严重性差异较大,目前本病仍未有特异性的诊断指标,在诊断以及鉴别诊断方面有较大的困难,由于ADNFLE多在夜间频繁发作,对患儿的身心健康有严重的影响。因此,寻找ADNFLE的致病基因及探讨其发病机制具有重要的意义。ADNFLE由Ingrid E. Scheffer等学者首次描述,以睡眠时出现成簇运动为特征,是第一个报道有明确基因突变导致的具有遗传背景的特发性家族性部分性癫痫。国内外大量的研究显示：ADNFLE与编码烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)亚基的基因突变有关,但具有一定的种族差异性。目前认为ADNFLE与三种编码乙酰胆碱受体的基因突变有关：CHRNA4、CHRNB2和CHRNA2。CHRNA4基因定位于20q13.2,是目前报道频率最高的突变,已证实的四种突变基因有Ser248Phe、263insL、S256L和T265I。CHRNB2定位于1q21,编码烟碱乙酰胆碱受体β2亚单位,是第二个ADNFLE被明确的相关致病基因。国内外学者已报道CHRNB2的6种突变与此病有关：V287L(意大利),V287M(苏格兰、西班牙),I312M(瑞士、韩国),L301V(土耳其),V308A(苏格兰、英格兰),V337G(中国),6种突变均位于CHRNB2的第5外显子。CHRNA2定位于8p12.3-q12.3,是第三个与ADNFLE相关的乙酰胆碱受体亚单位基因。目前报道的突变有I279N(意大利),通过电生理研究提示突变可以引起受体对钙的依赖性下降,离子通道的功能也有改变,多数学者认为大部分nAChR基因突变改变了离子通道的功能从而引发了癫痫的发作。ADNFLE具有明显的遗传异质性,各家系间及家系内成员临床表现和严重程度均有差别,目前发现明确基因突变的ADNFLE家系仅占全部家系的10%。一些散发病例在神经电生理特征、临床表现上与家系相似,故推测散发病例与家系有着相同的遗传背景。目前已知的基因突变多在家系中报道,国内对ADNFLE的研究尚处于临床水平。国内研究多集中在脑电图、临床辅助检查等综合分析,对于大样本的基因筛查研究较少,该病关于分子生物学方面的研究相对薄弱。因此,对于ADNFLE病例的分子生物学遗传机制值得进一步深入探讨。本实验我们共收集了中国人群ADNFLE患者257例,包括11个非亲缘家系,共42例家系患者和215例散发病例。前期已对其中的106例患者应用PCR产物直接测序的方法进行了CHRNA4、CHRNB2的基因筛查,未能发现已知的基因突变。在进一步扩大样本量的基础上,本实验对257例患者行CHRNA2及对151例患者行CHRNA4、CHRNB2的基因外显子筛查,进一步筛查可能与中国人群ADNFLE致病有关的新的基因突变,为ADNFLE的发病机制和遗传学研究提供新的研究方向,对ADNFLE进一步行分子遗传学研究,对阐明其发病机制以及开发新型药物,促进ADNFLE的有效治疗,控制疾病的发作以及改善患儿生活质量等具有深远的意义.[对象和方法]1.对象：收集2006年1月～2011年12月广东省人民医院及外院已确诊的中国人群(汉族)ADNFLE患者共257例,包括11个家系,共42例家系患者和215例散发病例,其诊断参照国际抗癫痫联盟2001年癫痫和癫痫综合征的分类诊断标准,对照组为健康人群200例。2.临床资料的收集：我们采用统一制定咨询表格,对所有患者完善视频长程脑电图、头部MRI检查,在征得患者或其监护人的同意下,对所有病例及对照组抽取外周静脉血,并详细询问、记录病史及家族史,建立相关资料库。3. CHRNA4、CHRNA2、CHRNB2基因突变筛查：(1)对257例(?)ADNFLE患者以及200例健康对照组所抽取的外周静脉血提取基因组DNA,并做好标记。(2)查找CHRNA4、CHRNA2、CHRNB2基因组标准序列,应用在线引物设计软件对全部编码区外显子设计引物,采用PCR技术特异性扩增CHRNA4基因的1-7外显了片段及CHRNA2、CHRNB2基因的1-6外显子片段。(3)所有PCR产物采用ABI3730测序仪进行测序,测序结果应用Vector NTI8.0分析软件进行分析,并与基因的标准序列进行比对标记,突变位点需进一步在200例健康对照组中进行验证,以排除是基因的多态性改变。[结果]1.本实验共收集ADNFLE患者257例,其中11个家系,42例家系患者和215例散发病人,男女患者比例约为1：1,根据家系临床相关资料分析表明ADNFLE的遗传模式属于常染色体显性遗传。所有患者根据临床表现及各项辅助检查均符合常染色体显性遗传夜间额叶癫痫的诊断。2.前期已对106例患者行CHRNB2及CHRNA4的基因突变筛查,均未发现已报道的热点突变。现在扩大样本量的条件下,对257例患者行CHRNA2及在前期研究的基础上对151例患者行CHRNA4、CHRNB2的基因外显子筛查,结果显示在所有病例中均未发现迄今已报道的CHRNA4的4个突变位点(S248F、S284L、263ins、T265I) CHRNB2的6个突变位点(V287L、V287M、I312M、L301V、 V308A, V337G)和CHRNA2的1个突变点I279N。3.在CHRNA2的第2、5外显子上筛查到3种c.SNP(c.66C>T,c.249C>T,c.375A>G),CHRNA4第5外显子上筛查到6种c.SNP(c.639T>C,c.678T>C,c.1209G>T, c.1227T>C, c.1659G>A, c.1629C>T)。4.在一患者中新发现CHRNA4基因的同义突变(c.570C>T),此改变位于CHRNA4第五外显子上,并未引起编码氨基酸的变化(D190D),且在200例健康对照组中为阴性。[结论]1.本实验对257例ADNFLE患者,包括11个家系及215例散发病例应用PCR产物直接测序的方法,成功扩增了CHRNA4、CHRNA2和CHRNB2的编码区全部序列,测序结果分析末发现至今国内外已经报道的热点突变,故推测CHRNA4、CHRNB2和CHRNA2可能不是中国人群ADNFLE的致病基因,同时进一步证实ADNFLE具有明显的遗传异质性。2。在一患者CHRNA4基因第五外显子编码区筛查到一新同义突变(c.570C>T),虽然此改变并未引起编码氨基酸的变化,但是否影响mRNA的转求,从而与中国人群ADNFLE的致病有关,仍需进一步扩大样本量进行验证。