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目的本研究通过检测结直肠癌细胞系HCT116和HT29的miR-192的表达差异,观察高表达miR-192和封闭miR-192的功能对结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移、克隆形成和成球能力的影响;并初步探索miR-192的生物靶标及其调控机制,进一步研究其靶基因在结直肠癌中的表达及其与结直肠癌临床特征的关系。方法1采用荧光实时定量PCR检测结肠癌组织、癌旁正常组织以及结直肠癌细胞系HCT116和HT29中miR-192及CXCL2m RNA表达水平。2 CCK-8和克隆形成实验检测细胞生长,观察miR-192对结直肠癌细胞增殖的影响。3结直肠癌细胞穿孔实验观察miR-192对癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。4结直肠癌细胞划痕实验观察miR-192对癌细胞的迁移能力的影响。5成球实验观察miR-192对结直肠癌干细胞自我更新能力的影响。6 miRDB和Target Scan预测miR-192的候选靶基因。然后将CXCL2的3’-UTR区的野生型和突变型基因插入到双荧光素酶报告基因载体中构建报告基因质粒。HCT116细胞高表达miR-192后,将报告基因质粒转染到HCT116细胞中,用双荧光素酶报告实验和Western blot实验证实miR-192的靶基因。7 Western blot方法检测CXCL2在结直肠癌组织和癌旁正常组织中的表达;ELISA方法检测CXCL2在结直肠癌、健康对照和非肿瘤患者对照血清中的表达,分析CXCL2的表达与结直肠癌临床特征的关系,同时采用电化学发光法测定血清中的CEA和CA19-9的表达。结果1结直肠癌组织中miR-192的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01),CXCL2 m RNA表达水平明显升高(P<0.01);且miR-192的表达与CXCL2m RNA表达水平呈负相关。结直肠癌细胞HCT116中的miR-192表达水平明显低于HT29(P<0.01)。2 CCK-8法检测细胞生长实验结果显示,miR-192高表达组的HCT116细胞在450nm的吸光度值明显低于阴性对照组细胞(P<0.05);高表达zip-miR-192的HT29细胞在450nm的吸光度值明显高于阴性对照组细胞(P<0.05)。克隆形成实验结果显示miR-192高表达组的HCT116细胞克隆数明显低于对照组细胞(P<0.05),高表达zip-miR-192的HT29细胞克隆数明显高于对照组细胞(P<0.05)。3细胞穿孔实验结果显示,高表达miR-192的HCT116细胞中发生侵袭和迁移的细胞数较对照细胞均明显减少,侵袭率明显下降(P<0.05);高表达zip-miR-192的HT29细胞中发生侵袭和迁移的细胞数较对照细胞均明显增多,侵袭率明显升高(P<0.05)。4划痕实验结果显示,与对照质粒组比较,miR-192高表达组的HCT116细胞迁移能力明显降低,划痕愈合较慢;zip-miR-192高表达组的HT29细胞迁移能力明显提高,划痕愈合较快。5成球实验结果显示,高表达miR-192的HCT116细胞中成球比例较对照细胞明显下降(P<0.05);高表达zipmiR-192的HT29细胞中成球比例较对照细胞明显上升(P<0.05)。6双荧光素酶报告实验和Western blot结果提示,CXCL2是miR-192的作用靶基因。7 Western blot结果显示,结直肠癌中的CXCL2蛋白表达明显高于癌旁正常组织;ELISA结果显示,结直肠癌患者血清中的CXCL2蛋白浓度明显高于健康对照组和非肿瘤患者对照组(P<0.01)。CXCL2蛋白表达水平与肿瘤TNM分期(P<0.01)及侵润深度(P<0.05)均呈正相关,与肿瘤分化程度、肿瘤栓塞、淋巴结转移、病理类型和性别无关。CXCL2检测结直肠癌的敏感度和特异度分别为56.1%(69/123)和95.31%(203/213)。将CXCL2、CEA和CA19-9阳性样本叠加后,诊断Ⅰ期结直肠癌的敏感度为22.2%(4/18),诊断Ⅱ期结直肠癌的敏感度为66.7%(26/39)。CXCL2的ROC曲线下面积(0.834)高于CEA(0.739)和CA19-9(0.676)。结论1结直肠癌组织中miR-192异常低表达,CXCL2高表达,二者呈负相关;侵袭能力较强的结直肠癌细胞HCT116中的miR-192表达明显低于侵袭能力较弱的结直肠癌细胞HT29;HCT116细胞中的CXCL2表达明显高于HT29细胞。2miR-192通过作用于CXCL2的3’-UTR区负向调控其表达。3 miR-192表达上调可以有效抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成和成球能力。抑制miR-192的功能可以增强结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、克隆形成和成球能力。4结直肠癌组织的CXCL2表达异常增高,表明其可能参与肿瘤的发生及发展过程;结直肠癌血清中的CXCL2蛋白浓度升高,显示CXCL2可能是一个有效的结直肠癌检测标志物。