钩端螺旋体病(Leptospirosis,钩体病)是一种全球分布的、洪涝时重点监控的人畜共患传染病,是我国重点防疫和监控的主要传染病之一。问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans,以下简称问号钩体)是钩体病的主要病原体,然而其致病机制至今仍不明确。据报道,无论是真核生物还是原核生物,当遭遇不利环境时,其胞内蛋白将会受到损伤,甚至变性失活,而AAA+(ATPasesAssociatedwith diverse cellular Activities)蛋白酶/蛋白酶体将会负责降解这些受损伤或变性的蛋白。我们推测,对于问号钩体而言感染也是一种不利环境,可能会导致钩体蛋白受损或变性失活,而钩体蛋白酶体很有可能负责处理或降解这些蛋白,以利于钩体在宿主体内的生存和繁殖。借助生物信息学分析手段,我们推测钩体至少包含以下三种类型的蛋白酶体:HslUV(ClpYQ)、ClpAP和ClpXP。在本研究中,以问号钩体黄疸出血群赖型赖株HslU和HslV为主要研究对象,我们发现无论是重组 HslU/HslV(rHslU/rHslV)还是天然 HslU/HslV(nHslU/nHslV)蛋白复合体(r/nHslU1-8HslV1,即r/nHslU与r/nHslV的摩尔比分别为1:1～8:1)仅能水解糜蛋白酶样底物,其Km值和Kcat值分别为43.3 μmol·L-1和51.7 s-1,且其水解能力仅能被苏氨酸蛋白酶抑制剂阻断。荧光共聚焦显微镜检查和荧光分光光度法检测结果表明,在问号钩体感染J774A.1巨噬细胞过程中,其胞内受损或变性蛋白水平显著增加,而在hslU和hslV基因缺失突变株(△hslUV)中,这类蛋白增加尤为显著。采用相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术和多维液相色谱联用(LC-MS/MS)技术对感染过程中钩体胞内变性蛋白进行了鉴定,随后的KEGG通路和GO分析结果显示这些变性蛋白主要涉及问号钩体的核糖体组装、鞭毛装配、二元信号系统和跨膜转运过程。与野生株相比,△hslUV突变株在感染巨噬细胞过程中表现为死亡率升高、生长能力和活力下降现象,当以腹腔注射方式感染金地鼠(hamsters)后,突变株表现为LDs0降低、对金地鼠组织(肺、肝、肾)损伤程度减轻以及在金地鼠体内(肺、肝、肾、外周血和尿)载量减少现象。综合以上结果,我们发现问号钩体HslU和HslV蛋白可组成一个糜蛋白酶样苏氨酸蛋白酶型蛋白酶体复合体HslUV,这种蛋白酶复合体有助于问号钩体在宿主体内的生存、繁殖和播散。