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研究目的:环境重金属污染已成为严重影响人群健康的公共卫生问题,其中危害严重的重金属主要包括铅（Lead,Pb）、镉（Cadmium,Cd）和汞（Mercury,Hg）。这些重金属常共存于人类赖以生存的环境中并通过多种途径进入人体。国内外一般人群血液中均能同时检测到这三种重金属。本课题组前期研究发现一般人群血液负荷及其相关水平下的低浓度Pb、Cd和Hg混合物暴露可引起大鼠学习记忆损伤,然而机制尚不清楚。神经递质谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸（N-methylD-aspartate receptors,NMDA）依赖的突触可塑性在学习记忆中起重要作用。因此,本研究通过建立低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露的大鼠、原代培养的海马神经元以及急性分离脑片模型,探讨NMDA受体在低剂量重金属联合引起学习记忆及突触可塑性损伤中的可能机制作用,为低剂量重金属复合污染所致神经损伤的防治提供潜在新靶点。研究方法:1、低剂量重金属混合物暴露的原代海马神经元模型检测NMDA-m EPSCs和NMDA受体亚基表达影响建立一般人群血液负荷及其相关水平的浓度梯度低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露的原代培养海马神经元模型,具体暴露分组包括单个重金属暴露组、两个重金属混合物暴露以及三个重金属混合物暴露组。采用膜片钳技术结合特异性受体通道抑制剂,分离记录NMDA受体介导的微小兴奋性突触后电流（NMDA mediated mini excitatory postsynaptic currents,NMDA-m EPSCs）;应用Western blot技术检测NMDA受体亚基（NR1、NR2A和NR2B）蛋白表达水平。2、低剂量重金属混合物急性灌流暴露的大鼠脑片模型检测f EPSP影响在一般人群负荷相关水平的浓度梯度低剂量Pb、Cd和Hg混合物急性灌流暴露的大鼠脑片模型上,采用脑片钳技术记录灌流前后海马组织Schaffer侧枝场兴奋性突触后电位（Field excitatory post synaptic potential,f EPSP）斜率Slope比值。3、低剂量重金属混合物暴露大鼠模型检测学习记忆、LTP以及NMDA受体亚基表达影响性成熟（8周龄）SD大鼠雌雄按2:1比例配对合笼,将受孕成功的雌性大鼠随机分至Control组（饮蒸馏水,对照组）、1×Pb+Cd+Hg混合物暴露组（饮用含有20.0 mg/L的三水合乙酸铅、7.0 mg/L的氯化镉和0.1 mg/L的氯化汞混合液染毒）、5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组（染毒剂量为1×Pb+Cd+Hg混合物暴露组的5倍）,选择其雄性仔鼠作为研究对象,通过母乳染毒至断乳,即出生后21天行各项试验。通过电感耦合等离子体质谱仪（Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）检测仔鼠全血和脑组织中Pb和Cd的含量,冷蒸汽原子荧光光谱法（Cold vapor atomic fluorescence spectrometry,CV-AFS）测定全血及脑组织Hg的含量。通过Morris水迷宫试验检测大鼠空间学习记忆能力。应用膜片钳技术记录大鼠海马长时程增强（Long-term potentiation,LTP）的诱导情况。使用HE染色分析大鼠海马结构及神经元形态。利用Golgi-cox染色法观察大鼠海马各区域树突棘密度及形态。通过Western blot和PCR检测NMDA受体亚基（NR1、NR2A和NR2B）蛋白及基因表达水平。研究结果1、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对海马神经元NMDA受体介导m EPSCs的影响在低剂量重金属混合物暴露的原代海马神经元模型上,采用膜片钳技术结合特异性受体通道抑制剂,分离记录NMDA受体介导的m EPSCs。结果发现,Pb+Cd+Hg混合物暴露引起m EPSCs幅度浓度依赖性降低,5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组m EPSC幅度较Control组明显降低（P＜0.01）。而与5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组相同浓度的5×Pb、5×Cd、5×Hg单个重金属及5×Pb+Cd、5×Pb+Hg、5×Cd+Hg两个重金属混合物暴露组m EPSCs与Control组相比均无统计学差异（P＞0.05）。以上结果提示,当单个重金属均低于未观察到有害作用水平（no observed adverse effect levels,NOAELs）时,Pb、Cd、Hg联合可引起协同神经毒性抑制NMDA受体介导的突触传递损伤。2、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对海马神经元NMDA受体亚基表达的影响通过Western blot检测海马神经元NMDA受体亚基表达水平发现,NR1和NR2A的蛋白表达水平随Pb+Cd+Hg混合物暴露剂量增加呈浓度依赖性降低,且1×Pb+Cd+Hg和5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组均较Control组出现明显降低（P＜0.05）。而各暴露组NR2B蛋白表达水平与Control组相比无统计学差异（P＞0.05）。3、急性Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠脑片海马f EPSP的影响在低剂量重金属混合物急性灌流暴露的大鼠脑片模型上,采用膜片钳技术记录灌流前后海马Schaffer侧枝场电位（f EPSP）斜率Slope比值。结果发现,与Control组相比,随着Pb+Cd+Hg混合物暴露剂量增加,Slope比值呈现浓度依赖性降低,且15×Pb+Cd+Hg混合物暴露组即出现显著降低（P＜0.05）。而与15×Pb+Cd+Hg混合物暴露水平相同的单个重金属暴露组则无明显变化（P＞0.05）。4、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠海马LTP的影响通过ICP-MS及CV-AFS检测发现,动物模型仔鼠全血和脑组织中重金属Pb、Cd、Hg含量随饮水暴露剂量的增加呈浓度依赖性增加（P＜0.01）。且1×Pb+Cd+Hg混合物暴露组仔鼠血液Pb、Cd及Hg含量分别为28.03±4.26μg/L、0.63±0.14μg/L、1.38±0.05μg/L,与中国一般人群血液负荷水平接近（Pb 34.90μg/L、Cd 0.49μg/L、Hg 1.81μg/L）。应用膜片钳技术记录大鼠海马LTP的诱导情况发现,LTP诱导30min后,5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组LTP斜率较Control组明显降低。而诱导60min后,1×Pb+Cd+Hg、5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组LTP斜率均较Control组出现明显降低（P＜0.05）。以上结果揭示,Pb、Cd和Hg混合物暴露可引起大鼠海马突触功能可塑性失调。5、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠学习记忆的影响通过水迷宫试验发现,各暴露组大鼠寻找到平台所用的逃避潜伏期时间随暴露剂量的增加而延长,且1×Pb+Cd+Hg和5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组与Control组相比均显著延长,且有统计学差异（P＜0.05）。6、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠海马神经元形态的影响HE染色观察大鼠海马结构及神经元形态发现,Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠海马结构和神经元形态无明显影响。各暴露组海马形态结构发育基本完全,呈现典型的CA1、CA3区锥体细胞层和DG区颗粒细胞层,各组间细胞形态均无明显变化。7、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠海马神经元树突棘密度和形态的影响经Golgi-cox染色发现,大鼠海马CA1和DG区1×Pb+Cd+Hg和5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组的树突棘密度较Control组均出现降低（P＜0.05）,CA3区5×Pb+Cd+Hg混合物暴露组树突棘密度降低（P＜0.05）。同时,Pb、Cd和Hg混合物暴露导致大鼠海马树突棘类型改变。CA1、CA3和DG区蘑菇型和细长型树突棘均随着重金属混合物暴露剂量出现浓度依赖性下降（P＜0.05）。以上结果提示,Pb、Cd和Hg混合物暴露可引起大鼠海马突触结构可塑性紊乱。8、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露对大鼠海马NMDA受体亚基表达的影响通过Western blot检测发现,NR1和NR2A亚基蛋白表达随Pb、Cd和Hg混合物暴露浓度增加剂量依赖性降低,1×Pb+Cd+Hg混合物暴露组即表现出显著差异（P＜0.05）,而各暴露组NR2B亚基蛋白表达则无明显差异（P＞0.05）。此外,通过RT-PCR和荧光定量PCR技术检测发现,与Control组相比,各暴露组NR1、NR2A和NR2B亚基基因表达均无显著差异（P＞0.05）。结论:1、当单个重金属均低于NOAELs时,Pb、Cd、Hg联合可引起协同神经毒性抑制NMDA受体介导的突触传递损伤;2、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露可引起大鼠海马突触功能和结构可塑性紊乱,并且具有剂量-反应关系;3、低剂量Pb、Cd和Hg混合物暴露所致大鼠学习记忆损伤,可能与海马神经元NMDA受体相关的突触可塑性有关。