论文部分内容阅读
实验目的:探讨MN-08对脂多糖(LPS)诱导小鼠急性肺损伤的治疗作用和作用机制;以及建立小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7炎症模型和肺II型上皮细胞A549损伤模型,观察MN-08对于RAW 264.7细胞炎症模型和A549细胞损伤模型的干预作用。实验方法:1.建立LPS诱导小鼠ALI模型,给予不同剂量MN-08治疗。通过观察小鼠精神状态、称量肺湿重干重并计算其比值、检测肺泡灌洗液蛋白含量和肺组织谷氨酸浓度,采用ELISA试剂盒、全自动生化分析仪、组织病理染色、免疫组织化学染色以及免疫印迹法综合分析MN-08对急性肺损伤的治疗作用及相关机制。2.在体外培养RAW 264.7细胞中,通过给予不同浓度MN-08预保护1 h,除正常对照组外,各组给予1μg/mL LPS刺激,然后采用细胞荧光探针技术、ELISA试剂盒和免疫印迹法检测MN-08对RAW 264.7细胞内ROS、炎症因子及信号通路相关蛋白表达的影响。3.在体外培养A549细胞中,通过给予不同浓度MN-08预保护1 h,除正常对照组外,各组给予10μg/mL LPS刺激,然后利用免疫荧光染色和免疫印迹法检测MN-08对A549细胞凋亡通路及紧密连接结构的影响。实验结果:1.小鼠肺组织湿重干重比值和肺泡灌洗液蛋白浓度结果表明,MN-08具有改善小鼠肺组织水肿情况及降低小鼠肺泡通透性的作用。2.小鼠肺组织及血清分子生物学研究结果显示:与经LPS诱导的模型组小鼠相比,MN-08组小鼠的血清炎症因子TNF-α和IL-1β的水平显著降低。MN-08明显抑制肺组织MPO的活力,GLU的浓度和MDA的含量,增加SOD的活性和GSH的水平。此外,MN-08在肺组织中有效地下调MAPK信号通路p38MAPK、ERK和JNK的磷酸化水平,抑制NF-κB信号通路NF-κB p65的核转移。3.小鼠肺组织病理学及免疫组化研究结果显示:经LPS诱导的模型组小鼠肺组织H&E染色有明显的炎症细胞浸润,肺泡壁增厚,出血及水肿。而不同剂量的MN-08治疗后,上述情况得到不同程度的改善。免疫组织化学染色结果表明,模型组小鼠肺组织紧密连接结构受到明显的破坏,MN-08能够有效提高肺组织紧密连接结构蛋白ZO-1、JAM-1及Claudin-1的水平,改善肺的肺渗透性。4.在体外培养RAW 264.7细胞炎症模型中:与LPS组相比,MN-08能够有效降低细胞内活性氧簇ROS的水平,抑制RAW 264.7细胞促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌,下调iNOS、COX-2及TNF-α蛋白的表达,以及上调抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的表达水平。5.在体外A549细胞损伤模型中:MN-08发挥抑制A549细胞凋亡的作用,上调Bcl-2蛋白的表达量而下调Bax蛋白的表达量。此外,MN-08促进A549细胞紧密连接结构ZO-1、Occludin、JAM-1及Claudin-1蛋白的表达水平,改善肺组织的通透性。实验结论:MN-08通过拮抗NMDA受体过度激活,抑制MAPK/NF-κB信号通路和激活Nrf2/HO-1信号通路发挥抗炎和抗氧化作用,从而保护肺上皮细胞的凋亡,改善肺水肿情况,进一步减轻肺损伤程度。