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目的本课题通过高糖高胰岛素诱导Hep G2细胞建立胰岛素抵抗模型,探究海普诺(HPN)对胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖消耗量的影响,和对胰岛素抵抗Hep G2细胞内蛋白水平及磷酸化水平改善作用,并初步探讨可能的分子生物学机制,为HPN的进一步的开发利用提供实验依据。方法1.用Cell Counting K it-8(CCK-8)法研究不同浓度的HPN对肝癌细胞株(Hep G2)细胞活性的影响。体外培养Hep G2细胞,CCK-8法检测浓度为(1×10-7~1×10-4mol/L)的HPN作用Hep G2细胞后24 h,36 h和48 h的存活率。以及在倒置显微镜下观看各个浓度的HPN作用Hep G2细胞48 h细胞形态的变化。2.胰岛素抵抗Hep G2细胞模型的建立。实验设立对照组和模型组,将含有胰岛素培养液中培养的Hep G2细胞作为模型组,不含胰岛素的培养液中培养的Hep G2细胞为正常对照组。以浓度为30 mmol/L D-葡萄糖和不同浓度的胰岛素(1×10-7~5×10-6 mol/L)的培养基培养Hep G2细胞72 h,后换正常的培养基持续6 h后检测细胞上清液中葡萄糖消耗量,以确定高糖高胰岛素诱发的Hep G2细胞胰岛素抵抗造模最佳胰岛素浓度。3.胰岛素抵抗模型建立以后,用不同浓度的HPN作用胰岛素抵抗Hep G2细胞6h,用多功能自动生化仪葡萄糖-己糖激酶法检测不同浓度的HPN对Hep G2细胞上清液中的葡萄糖消耗量的影响。4.蛋白免疫印迹法(Western blot)检测HPN处理的胰岛素抵抗Hep G2细胞6 h后细胞内PTP-1B,IRS-1,Akt蛋白的蛋白水平以及IRS-1(Tyr612)酪氨酸磷酸化,Akt(Ser473)丝氨酸磷酸化水平。结果1.CCK-8结果显示在低浓度时HPN促进Hep G2细胞增殖的作用,细胞活性与HPN浓度的呈负相关,并对时间的依赖性不明显;倒置显微镜下观看细胞形态及数量有明显改变,尤其在HPN浓度为1×10-4 mol/L时。2.高糖和高糖高胰岛素均能诱导Hep G2细胞胰岛素抵抗模型的建立,诱发Hep G2细胞胰岛素抵抗造模最佳胰岛素浓度为1×10-6 mol/L,D-葡萄糖浓度为30mmol/L。3.在胰岛素抵抗Hep G2细胞中,在HPN浓度为5×10-8~1×10-7 mol/L时都能促进胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖消耗(P<0.05),尤其当HPN浓度为1×10-7 mol/L时,能显著促进胰岛素抵抗Hep G2细胞葡萄糖消耗(P<0.01)。4.经Western Blot结果检测显示,经HPN处理的胰岛素抵抗Hep G2细胞中较模型组PTP-1B蛋白表达水平有明显的下降,IRS-1蛋白表达水平有明显升高,而IRS-1(Tyr612)的酪氨酸磷酸化;虽其下游PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白没有明显变化,但能引起Akt(Ser473)的丝氨酸的磷酸化水平有明显升高,故HPN促进胰岛素信号通路下传,增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取。结论HPN能明显促进胰岛素抵抗Hep G2细胞的葡萄糖摄取和增强胰岛素信号下传,可能通过抑制细胞内PTP-1B蛋白水平的表达,增强胰岛素信号中IRS-1蛋白表达,提高IRS-1(Tyr612)酪氨酸磷酸化,和影响其下游PI3K/Akt信号通路中Akt(Ser473)丝氨酸磷酸化水平,提高对胰岛素敏感性,从而达到改善胰岛素抵抗的目的。