阿糖鸟苷(9-beta-D-arabinofuranosylguanine,ara-G)合成抗白血病药物奈拉滨、氟达拉滨等的重要前体。传统的化学合成法存在步骤繁琐、易产生异构体且异构体不易分离等困难,而采用微生物游离细胞或酶进行合成时,由于细胞或酶不能够重复使用而导致成本较高。本文采用固定化酶技术进行ara-G的生物合成研究,以建立连续催化的反应工艺,达到降低生产成本、实现工业化生产的目的。利用超声波处理将菌体细胞破碎、硫酸铵分级盐析制备酶液,通过对固定化的条件如戊二醛浓度、处理时间、酶联时间等进行优化,得到两种酶的适宜固定化条件。其中嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)固定化条件优化为:在室温、振荡条件下用0.2%戊二醛与树脂混合4h,去离子水清洗至中性,1g树脂结合63.2 u PNPase酶,酶液与树脂酶联12h,过滤后用蒸馏水洗涤至中性,得到高活性固定化PNPase酶。腺苷脱氨酶(AMPDAase)固定化条件为:在室温、振荡条件下用0.1%戊二醛与树脂混合8h,去离子水清洗,1g树脂结合51.4 u AMPDAase酶,酶液与树脂酶联10h,过滤后用蒸馏水洗涤至中性,得到高活性固定化AMPDAase酶。以阿糖尿苷(ara-U)和2,6-二氨基嘌呤核苷(DAP)为底物、以固定化的PNPase酶为催化剂,在摇瓶水平考察影响阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA)合成的理化因素,其最优条件为:在100ml的50 mmol/L、pH 7.5磷酸盐缓冲液中加入50 mmol/L ara-U和50 mmol/L DAP、固定化PNPase酶(树脂)2g,60℃反应48h。在分批反应时,固定化PNPase酶可反复多批次使用,前5个批次反转化率较高,最高可达84.93%,5次平均转化率为63.9%,但之后转化率下降较快。在分批试验的基础上建立了酶柱连续反应工艺,酶柱的填径高比为5.5,通过蠕动泵将底物溶液连续流加到酶柱上,利用恒温水浴装置控制反应的温度。单因素分别考察连续催化反应条件,得到最适的连续催化条件:采用pH7.2的45 mmol/L磷酸盐缓冲液,ara-U、DAP浓度分别为50 mmol/L,反应底物流加速度为0.47 ml/min的,反应温度58℃。在此连续催化工艺条件下,酶柱的连续催化效果良好,在连续反应578h内,转化率仍然保持在42%以上,最初转化率最高可达83.74%,在连续反应144h内保持78.44%高转化率。酶柱连续催化效力是游离细胞的45.5倍,是固定化酶分批次反应的16.3倍。进一步以ara-DA作为底物、固定化AMPDAase酶为催化剂,在摇瓶水平考察影响ara-G合成的理化因素,其最优条件为:在100ml的pH 7.5、150 mmol/L磷酸盐缓冲液中加入30 mmol/L ara-DA、1.5g固定化AMPDAase酶,于58℃进行脱氨反应108h。在上述条件下进行8个批次的重复反应,其中最高转化率为82.2%,平均转化率为64.47%,表明固定化AMPDAase酶活稳定,可多次重复使用。在此基础上建立了酶柱连续反应工艺。单因素分别考察连续催化反应条件,得到最适的连续催化条件:酶柱装填的径高比为5.5采用pH 7.6的160 mmol/L磷酸盐缓冲液,ara-DA浓度为30 mmol/L,反应底物流加速度为0.30 ml/min的,反应温度54℃。在此连续催化工艺条件下,酶柱的连续催化效果良好,在连续反应624h内,转化率仍然保持在40%以上,最初转化率最高可达86.78%,在连续反应192h内保持80.33%的高转化率。酶柱连续催化效力是游离细胞的21倍,是固定化酶分批次反应的11倍。通过上述研究建立了两步固定化酶法合成ara-G的生物转化工艺,一方面提高了催化反应的转化率,另一方面由于固定化细胞可重复使用性或固定化酶的连续长时间催化反应效能,极大地降低了产物的生产成本,为ara-G的微生物转化法工业生产成奠定了技术基础。