广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth.)是著名的岭南道地药材,十大广药之一,是临床常用的芳香化湿药。从广藿香中提取的广藿香油是医药工业和轻化工业的重要原料,市场需求量大。广藿香是获得广藿香油的唯一天然来源,其最主要的成分是广藿香醇(Patchoulol),又称为“百秋李醇”,是一种代表性的倍半萜类物质,具有很好的神经保护、抗流感病毒、抗多种真菌、抗肿瘤、抗炎症等生物活性,更是我国历版药典中用于评价广藿香药材及广藿香油质量的指标成分。因此,广藿香醇的生物合成及其动态积累研究备受关注。随着功能基因组学、植物代谢检测分析技术和多组学技术的应用,广藿香萜类次生代谢模式和广藿香醇的生物合成途径被逐渐解析。研究表明,广藿香醇合酶(Patchoulol synthase,PatPTS)能直接催化法呢基焦磷酸(FPP)生成倍半萜类终产物广藿香醇,对于广藿香醇的合成积累最为关键。目前对广藿香的萜类合成在转录调控方面的研究尚没有报道,特别是缺乏直接剖析转录因子如何调控PatPTS的转录表达的研究,相关的转录调控机制和互作网络也未得到解析。因此,本研究率先开展了调控广藿香醇生物合成的转录因子的挖掘,采用三代测序技术构建了广藿香全长转录本数据库,结合酵母杂交技术,以PatPTS的启动子作为靶调控位点,通过文库筛选、分离克隆和体内外验证来获得一系列转录因子,并联合植物基因工程和代谢分析对其功能进行深入研究,以阐明广藿香醇生物合成途径中转录因子对PatPTS的调控机制,为广藿香优良品种培养及广藿香醇合成研发工作提供理论支撑和技术参考。研究的技术方法和结果概况如下:1广藿香全长转录本数据库及酵母杂交文库的构建和分析1.1基于PacBio三代测序的转录本识别和分析采用PacBio单分子实时测序技术(Singlemolecular real-time,SMRT)构建了广藿香全长转录组参考图谱,重构获得了 82,335个全长转录本,共有65,826个转录本在Nr、Swissprot、GO、KEGG等数据库获得注释,注释率为79.95%。其中注释为萜类生物合成相关途径相关的转录本有103个,共包括广藿香醇合成相关关键酶基因16个,并分析获得3,176个转录因子序列,分别属于90个不同的家族。1.2酵母杂交cDNA文库的构建和质量分析利用 Invitrogen 的 CloneMiner Ⅱ cDNA Library Construction Kit 构建来广藿香高质量酵母杂交cDNA文库,其库容为8.6×106CFU,重组率为>95%,满足次级文库要求,可用于后续文库筛选试验。2 PatPTS启动子克隆及其转录调控因子的筛选2.1 PatPTS及其启动子的克隆分析从广藿香转录组数据库筛选获得PatPTS的全长转录本,设计引物克隆获得PatPTS基因1,659 bp ORF序列和3,392 bp gDNA序列,以及854 bp启动子序列。采用PlantCARE和New PLACE等数据库对该启动子进行顺式作用元件分析,发现该启动子含有转录起始核心元件TATABOX、增强子核心元件CAATBOX等必须元件,同时含有E-BOX、I-BOX等多种转录因子的结合元件,还含有JA、ABA、Ethylen(乙烯,ET)等激素响应元件。2.2结合PatPTS启动子的转录因子的初步筛选和鉴定通过酵母单杂交(Y1H)文库筛选以PatPTS的启动子为诱饵从广藿香cDNA文库中获得约200个候选基因片段。通过NCBI、Uniprot等数据库进行候选片段注释分析,从广藿香的全长转录本数据库提取候选基因的全长转录本进行分析及克隆;然后构建酵母AD载体,并与诱饵质粒共转至酵母Y187重复酵母单杂交验证,结果表明 PatDREB、PatERF061、PatSWC4、PatASIL2、PatGATA17和PatGIS2等6个蛋白在酵母体内可以结合PatPTS的启动子。3转录因子调节PatPTS基因表达参与广藿香醇合成调控的机制3.1广藿香MYC2转录因子的克隆及转录调控研究(1)据文献报道MYC2转录因子在植物萜类化合物的代谢合成中具有重要的调控作用,因此本研究还对广藿香中MYC2转录因子进行了克隆,并探究其对PatPTS的转录调控功能进行分析。从广藿香的全长转录组数据库筛选出1 1条注释为MYC的全长转录本,设计引物克隆获得8个MYC编码序列,对序列进行生物信息学分析表明PatMYC2a、PatMYC2b1和PatMYC2b2具有高度保守bHLH-MYC-N、bHLH-Zip和ACT-like功能域。这3个PatMYC2在拟南芥原生质体中均定位于细胞核,均具有转录激活活性,缺失表达实验表明PatMYC2a和PatMYC2b2的转录激活功能域为bHLH-MYC-N蛋白保守结构。RT-qPCR分析表明3个PatMYC2在不同组织部位均有表达,低温和光照处理后3个PatMYC2呈现相似的表达模式。(2)在本氏烟中进行的双荧光素酶(Dual-luc)实验和在广藿香叶片中瞬时过表达实验表明分别过表达PatMYC2a和PatMYC2b2能够激活PatPTS启动子的活性并促进PatPTS基因转录表达,同时可激活广藿香醇合成通路PatFPPS、PatIPPI、PatMVD、PatPMK、PatHMGS和PatAACT等多个关键酶基因的表达来促进叶片中广藿香醇的合成积累。3.2 DREB转录因子PatDREB和PatERF061介导的广藿香醇合成调控机制研究(1)Y1H实验中筛选得到的两个AP2/ERF家族转录因子均含有一段60个左右氨基酸构成的AP2保守结构域,均属于DREB亚家族,具有该亚家族的保守位点,其中PatDREB属于该亚族A-4组,PatERF061则属于A-6组。PatDREB在拟南芥原生质体的细胞核定位表达,而PatERF061则在细胞核和细胞质均有表达。两个DREB在不同组织均有表达,且转录表达水平受MeJA诱导,但表达模式有所差异。(2)酵母双杂交(Y2H)和荧光素酶互补(BiFC)实验结果表明,PatDREB和PatERF061分别能与茉莉酸信号通路的抑制蛋白PatJAZ4互作,而PatERF061能与PatJAZ4在拟南芥原生质体的细胞核共表达。Dual-luc实验进一步表明,PatDREB和PatERF061能显著激活PatPTS启动子的活性,它们的转录调控功能受PatJAZ4和MeJA水平影响,其中PatJAZ4通过与PatERF061结合而抑制其转录调控功能,而MeJA能够逆转这种抑制作用。外源MeJA能够抑制PatDREB转录调控功能,而PatJAZ4对PatDREB的转录功能影响不大。(3)广藿香叶片瞬时过表达实验表明,PatDREB和PatERF061均能通过激活广藿香醇合成途径的关键酶基因的表达,从而促进广藿香醇的合成积累。PatERF061与PatJAZ4共过表达则抑制广藿香醇的合成积累,与dual-luc结果一致。说明PatDREB和PatERF061是促进广藿香醇合成的重要转录因子,而且是茉莉酸信号通路的重要组分。3.3 MYB_related转录因子PatSWC4调控广藿香醇合成机制研究(1)Y1H筛选获得的PatSWC4为MYB_related家族转录因子,含有SANT/Myb-like domain of DAMP 1 和 DNA methyltransferase 1-associated protein 1(DMAP1)两个保守功能域。PatSWC4主要于细胞核定位表达,在广藿香各个组织部位均有表达,且其转录表达水平受MeJA诱导。Y2H和Dual-luc实验结果表明,PatSWC4能激活PatPTS启动子的活性,添加MeJA后,激活作用更显著提高;PatJAZ4通过与PatSWC4结合而抑制其转录激活功能,而施加MeJA则能逆转这种抑制作用。在广藿香叶片中瞬时过表达PatSWC4,能激活广藿香醇合成酶PatPTS和MVA途径PatFPPS等关键酶基因的表达;另外广藿香醇合成相关转录因子PatDREB、PatERF061和3个PatMYC2的表达也显著提高,从而促进了叶片中广藿香醇的合成和积累。(2)Y2H 和 Dual-luc 实验表明 PatSWC4 能分别与 PatDREB、PatERF061形成转录复合体,复合体能激活PatPTS的启动子活性,外源MeJA能抑制其激活作用。PatJAZ4能分别与PatSWC4、PatDREB、PatERF061结合,抑制转录复合体的形成,从而抑制PatPTS启动子的活性,这种作用在施加MeJA后可消除,甚至逆转。将PatSWC4分别与PatDREB、PatERF061在广藿香叶片中进行瞬时共过表达,也能显著促进广藿香醇的合成和积累。3.4 Trihelix转录因子PatASIL2调控广藿香醇合成机制研究(1)是Trihelix家族SIP1亚家族转录因子,N端有一个Trihelix保守结构域和一个第四α螺旋结构域,C端有一个卷曲螺旋结构域。预测发现在蛋白序列的中、下游共有两个核定位信号(NLS),PatASIL2在拟南芥原生质体亚细胞定位于细胞核,与预测一致。PatASIL2在不同的组织均有表达,且转录表达水平受MeJA的诱导。Dual-luc实验表明PatASIL2能抑制PatPTS启动子活性,施加MeJA后,PatASIL2则激活PatPTS启动子转录活性。广藿香叶片瞬时过表达PatASIL2能促进广藿香醇的合成和积累,激活广藿香醇合成途径PatFPPS、PatMVD等多数关键酶基因的表达,但抑制PatPTS的表达。(2)Y2H 和 BiFC 实验,表明 PatASIL2 能分别与 PatDREB、PatERF061 在细胞核形成转录复合体。PatASIL2分别与两个DREB瞬时共过表达都能促进广藿香叶片中广藿香醇的合成和积累。说明PatASIL2为广藿香醇合成的重要调控因子,且能与两个DREB形成转录调控复合体。3.5两个锌指蛋白可能调控广藿香醇的合成酵母单杂交筛选获得的PatGATA17和PatGIS2均为锌指蛋白。PatGATA17属于Zf-GATA转录因子家族,主要于细胞核表达;具有转录激活活性。该基因在广藿香根和成熟叶表达量较高,且受MeJA和低温诱导。PatGATA17能够结合PatPTS的启动子并激活其转录活性,进而促进广藿香醇的合成积累。而PatGIS2属于Zf-CCHC基因家族,通过结合PatPTS的启动子并抑制其转录活性,进而抑制广藿香醇的合成积累。综上所述,为挖掘鉴定广藿香醇生物合成的转录调控因子,本研究首先构建了广藿香的全长转录组和酵母杂交文库,根据转录组注释分离克隆了广藿香MYC2转录因子,并研究其在广藿香醇生物合成中的重要作用,以PatPTS的启动子为诱饵筛选并首次鉴定了 6个特异性调控PatPTS基因表达进而参与调控广藿香醇生物合成的转录因子,并利用瞬时过表达对其功能进行验证分析。PatDREB、PatERF061、PatSWC4和PatASIL2的基因表达和转录调控功能受外源MeJA诱导,可能为JA信号通路的下游响应转录因子。蛋白互作结果还表明两个DREB转录因子能够与MYB-like转录因子(PatSWC4、PatASIL2)形成转录复合体调控广藿香醇的合成。同时PatGATA17和PatGIS2作为调控广藿香醇合成的候选转录因子开展初步鉴定。本研究首次筛选获得多个转录因子,功能分析揭示了其调控广藿香醇生物合成的可能模型,不仅促进从转录调控上揭示广藿香醇的生物合成分子机制,在广藿香响应激素诱导的分子调控网络机理的解析取得突破,而且有助于广藿香及广藿香挥发油的质量控制,为利用代谢调控手段提高药用植物活性成分合成提供理论基础和应用借鉴。