木糖是木质纤维素类物质水解液中的主要糖分，其有效转化是实现木质纤维素类物质生物转化生产燃料乙醇及其它生物化工产品的关键步骤之一。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）虽然在工业生产中已有上百年的乙醇发酵应用历史，但由于缺乏有效转化木糖生成木酮糖的途径而不能代谢木糖。　　 通过代谢工程的手段，在酿酒酵母中表达木糖还原酶（XR，xylose reductase）基因XYL1和木糖醇脱氢酶（XDH，xylitol dehydrogenase）基因XYL2得到的重组酿酒酵母能够利用木糖生成乙醇。但目前研究表明，重组酿酒酵母代谢木糖的速度及乙醇产率仍然较低，究其原因主要有二：其一是因为XR（依赖NADPH）和XDH（依赖NAD+）发挥催化作用时所依赖的辅酶不平衡；其二是因为酿酒酵母缺乏专门用于木糖运输的戊糖转运子，使得其运输系统向细胞内运输木糖的能力不能满足高效利用木糖发酵生产乙醇的需要。　　 为了改善XR的辅酶依赖性，促进XR-XDH途径的氧化还原平衡，本论文通过基于生物信息学方法（序列比对，同源建模，酶与辅酶分子对接，能量计算）的定向进化策略，以树干毕赤酵母木糖还原酶（PsXR，Pichia stipitis XR）作为亲本酶进行定向进化。通过突变，获得了辅酶依赖性逆转的突变酶，在此基础上，再对突变酶的酶学性质、活力及其活力改变的分子机制等方面进行了较为系统的研究。　　 首先，从P．stipitis基因组中克隆得到XYL1、XYL2，将其在Ecoli BL21（DE3）中进行功能表达，纯化，并测定了它们的表达活力：XR以NADPH、NADH为辅酶时，表达活力分别为20．4 U/mg、6．8 U/mg； XDH以NADP+为辅酶时测不到表达活力，以NAD+为辅酶时表达活力为20．6 U/mg。　　 其次，采用反向长距离PCR技术对XYL1进行定点突变，得到了突变效果显著的两个XR单位点突变酶K21A，K270N。对突变后的酶的动力学参数以及基本酶学性质进行了分析，实验结果发现，以NADPH为底物时，亲本酶的Km值为0．025 mM，突变酶K21A、K270N的Km值均检测不到；以NADH为底物时，亲本酶的Km值为0．021 mM，K21A的Km值为0．032 mM，K270N的Km值为0．031 mM，说明K21A、K270N突变使得XR由亲本酶的NADPH、NADH双辅酶依赖性转变成了NADH单一辅酶依赖性。当以NADH为底物时，K21A、K270N突变酶对NADH的催化效率（kcat/Km）也有明显下降，kcat/Km值由亲本酶的36854 mM-1·min-1分别下降到了8812 mM-1·min-1、7215 mM-1·min-1。实验结果同时发现，N272D突变酶的辅酶依赖性变化虽然不大，但其对NADH的催化效率较之亲本酶有所上升，kcat/Km值由36854 mM-1·min-1上升到55365 mM-1·min-1，为亲本酶的1．5倍。　　 第三，为了提高突变酶对NADH的催化效率，在上述单位点突变的基础上，又增加了N272D位点的突变实验。突变酶的酶学性质研究结果显示，突变效果最好的酶为K21A/N272D，其辅酶依赖性仍然保持NADH专一，而且，当以NADH为底物时，kcat/Km值由K21A单位点突变的8812 mM-1·min-1上升到76230 mM-1·min-1，为K21A的8．7倍，约为亲本酶（36854 mM-1·min-1）的2．0倍。　　 第四，运用SAMM（Shanghai Molecular Modeling）软件模拟突变前后的酶结构，对具有代表性的突变酶氨基酸转换所导致的酶结构变化和可能的辅酶结合机制进行了初步分析、探讨，其结果进一步为酶的理性设计及酶分子改造提供了基础。　　 最后，为了进一步研究酿酒酵母木糖的代谢能力及速率，尝试将XYL1、XYL2分别表达到酿酒酵母细胞壁，以期能使木糖在细胞外转化成更易于运输的木酮糖，解决木糖运输瓶颈问题。本研究利用酿酒酵母凝素集表面展示系统，分别将XYL1、XYL2在酿酒酵母强启动子GAPDH控制下表达在MT8-1的细胞表面。经酶活力测定分析，XR、XDH在酿酒酵母表面得到了活性表达，完整细胞表达的XR、XDH活力分别为1．85 U/mg、1．88 U/mg，在细胞壁上表达的活力分别为1．84 U/mg、1．63 U/mg，实验结果证实酶活力主要存在于重组菌株的细胞壁上。　　 本研究将理性设计与定点突变相结合的方法用于改造XR的辅酶依赖性，获得了两个依赖性逆转的突变酶K21A、K270N。在此基础上，通过另一轮定点突变实验，得到了对催化效率有明显提高的突变酶K21A/N272D。突变酶的获得不仅有助于在酿酒酵母胞内构建木糖代谢的有效途径，同时，也有助于我们进一步了解XR结构与功能之间的关系。