灵芝(Ganoderma lucidum)是名贵的食药用真菌,灵芝多糖(polysaccharides)是灵芝主要的活性成分之一,众多研究表明,灵芝多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、抗纤维化、降血压等生物活性。灵芝多糖主要从发酵液、菌丝体及子实体中获得。目前关于灵芝多糖的研究大多集中在通过发酵调控技术增加其产量,而通过分子水平操作来调控多糖合成代谢的研究却很欠缺。本课题通过构建重组质粒,采用农杆菌转化法(ATMT)使得灵芝多糖代谢途径中的关键酶磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)、磷酸甘露糖异构酶(PMI)的基因在灵芝菌体内获得过表达,通过qRT-PCR法检测基因在转录水平的相对表达量,并对灵芝多糖产量及其单糖组成、及灵芝多糖合成途径中相关酶的酶活进行研究。此外,对野生型及重组型的灵芝菌株采用扫描电镜(SEM)与透射电镜(TEM)技术,观察其菌体形态和菌体细胞内超微结构的区别。研究结果主要有:1.由NCBI查找灵芝菌株中编码α-PGM、PMI蛋白酶的基因序列,使用DNAMAN软件设计引物,以所提灵芝总DNA为模板,经PCR扩增目的基因片段,核酸凝胶电泳检测并对其测序,结果显示基因序列一致。以pCAMBIA1301为骨架,采用同源重组的方法构建重组质粒PJW-PGM、PJW-PMI,根癌农杆菌介导转化灵芝原生质体,并从含有相应抗生素的平板上筛选出重组菌株。2.以野生型灵芝菌株为对照,研究发现灵芝重组菌株的菌体生物量与野生型相比有一定程度的提高,且其还原糖消耗速率更快。重组型菌株与野生型灵芝胞外多糖(EPS)和胞内多糖(IPS)的产量在整个发酵过程中的产量明显高于野生型灵芝。对发酵过程中多糖组成及比例的变化进行研究,结果表明,由于pgm、pmi基因的过表达,葡萄糖分别流向不同的合成代谢分支,影响灵芝多糖中的单糖组分及比例。利用RT-PCR技术从转录水平对参与糖核苷酸供体的重要酶进行验证,结果显示pgm、pmi基因的过表达,不仅使其自身在mRNA水平的相对表达量高于野生型菌株,也能促进其上下游基因的表达。以野生型灵芝菌株为对照,对参与灵芝多糖合成途径中糖核苷酸供体合成的相关酶的比酶活变化规律进行研究,结果发现重组型灵芝中不仅PGM、PMI的比酶活高于野生型,也促进多糖合成途径中磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPG)两种酶比酶活的提高。3.以野生型灵芝菌株为对照,对重组型灵芝菌株采用SEM与TEM技术,观察其菌体形态和菌体细胞内超微结构的区别。结果显示,SEM下重组型的菌体表面覆盖的灵芝多糖较野生型多,TEM下重组型与野生型的细胞内超微结构整体无明显差异。