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目的:阿尔茨海默病(AlzheimersDisease，AD)是一种以进行性记忆丧失和认知功能障碍为主要临床特征的神经退行性疾病。随着中国社会老龄化进程的加速，AD的患病率明显增加，严重影响着老年人的生活质量，给个人、家庭和社会造成沉重负担。AD的病因和发病机制十分复杂，目前尚不完全清楚。研究认为其发病机制主要与能量代谢失调、氧化应激损伤、免疫和炎症反应、胰岛素抵抗及Tau蛋白过度磷酸化等有关。近年来，异常表达的miRNA在AD发病中的作用已成为新的研究热点。文献表明，在AD发病早期，患者中枢神经系统的海马组织中miRNAs的表达出现失调。异常表达的miRNA可导致其下游的靶蛋白及相关信号通路发生改变。这些变化在AD的发生发展过程中发挥重要作用，但其确切的分子机制尚不明确。本研究采用基因芯片技术，对痴呆模型快速老化小鼠(SenescenceAcceleratedMouse-Prone/8，SAMP8)海马组织中miRNAs的表达谱进行分析，筛选出与AD发病相关的异常miRNAs，并运用Real-timePCR技术进行验证。通过生物信息学软件分析预测异常miRNAs的靶分子，并采用Westernblot、免疫组化和双荧光素酶实验技术研究异常miRNA对其靶蛋白调控的分子机制。本研究为阐明miRNAs在AD发病中的作用以及开发以miRNAs为靶点的相关药物提供理论依据。
方法:
1实验动物:选择3月龄、6月龄和9月龄SAMP8小鼠及其同源正常对照小鼠(SenescenceAccelerated-ResistantMouse1，SAMR1)作为研究对象。
2miRNA表达谱的检测:采用miRNA基因芯片GeneChip(r)miRNA2.0Array检测3月龄SAMP8及正常同龄对照SAMR1小鼠海马组织中miRNAs的表达谱的改变情况，并利用全基因组及代谢途径数据库(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG)分析异常表达的miRNAs可能参与的信号通路。
3差异性表达miRNA的验证:通过Real-timePCR验证目标miRNA—miR-181c在3月龄SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中的表达;进一步通过Real-timePCR检测miR-181c在3月龄SAMR1小鼠脑、心、肝、肾等组织的表达和3、6、9月龄SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中的表达及增龄性改变。
4miR-181c的生物功能富集分析:利用GeneOntology(GO)数据库分析miR-181c可能的生物学功能。
5靶基因的预测及验证:利用TargetScan，PicTar，PITA和miRanda四种靶基因预测软件综合预测miR-181c的靶基因，结合功能分析筛选出脑衰反应调节蛋白2（collapsinresponsemediatorprotein2，crmp2）作为目标靶基因，并通过Real-timePCR检测3、6、9月龄SAMP8小鼠和正常同龄对照SAMR1小鼠海马组织中crmp2mRNA的表达。
6CRMP2蛋白的表达:通过Westernblot和免疫组化的方法对SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中CRMP2靶蛋白进行定量和半定量分析，观察CRMP2蛋白的表达模式。
7双荧光素酶实验:通过构建crmp2基因3UTRs荧光素酶报告载体，与miR-181c前体序列或抑制物共同转染HEK-293细胞，通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。
8统计方法:所有数据采用(x)±s表示。用SPSS13.0软件进行数据处理，采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析，以p＜0.05为有统计学意义。
结果:
1miRNA芯片检测结果显示，与正常同龄对照SAMR1相比，SAMP8海马组织中表达差异在1.5倍以上的miRNAs有15个，其中8个表达上调，7个表达下调，且以miR-181c表达下调倍数最高，为3.08倍。这些表达下调miRNAs的靶基因可能参与轴突导向、细胞的增殖与分化和泛素介导的蛋白水解等信号通路。
2与同龄正常对照组SAMR1相比，3月龄SAMP8小鼠海马组织中miR-181c表达降低，与芯片结果一致;与正常同龄对照组SAMR1相比，3月龄和6月龄SAMP8小鼠海马组织中miR-181c表达均下降(p＜0.05)，9月龄时，miR-181c在SAMR1和SAMP8小鼠海马组织中的表达无明显差异(p＞0.05)。
3miR-181c在小鼠海马和脑皮质中的相对表达量明显高于心脏、肝脏和肾脏组织(p＜0.05)。
4miR-181c的GO分析结果提示miR-181c可能参与了对转录过程的调节、神经元分化、神经元突触和轴突的发育等生物学过程。
5Westernblot检测结果显示，与正常同龄对照组SAMR1相比，3、6和9月龄SAMP8小鼠海马组织中，软件预测的miR-181c靶蛋白CRMP2及CRMP2磷酸化蛋白的表达均明显升高(p＜0.05);3、6和9月龄SAMP8小鼠海马组织中CRMP2蛋白表达呈增龄性升高(p＜0.05)。免疫组化结果显示，CRMP2蛋白主要表达在小鼠海马组织的CA3区，DG区和CA1区几乎没有阳性表达。
6双荧光素酶活性检测结果显示，共转染miR-181c前体组，荧光素酶活性明显减低，而转染miR-181c抑制物组荧光素酶活性则显著增高(p＜0.05)。
结论:
1SAMP8小鼠海马组织中多种miRNAs表达失调，可能通过轴突导向、细胞的增殖与分化和泛素介导的蛋白水解等信号通路参与脑老化及神经退行疾病的发病过程。
2miR-181c表达的下调可减弱对其靶基因crmp2的转录后抑制过程，导致CRMP2蛋白的高表达，在AD发生发展中可能发挥重要作用。