乳腺癌干细胞新型多肽标志物的筛选及鉴定

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研究背景及目的:目前,乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,过去20年中乳腺癌的发病率逐步升高。虽然乳腺癌的早期诊断和综合治疗已取得很大进步,但仍有部分患者出现局部复发或远处转移。随着人们对肿瘤发生机制的研究以及肿瘤干细胞理论的提出,实体瘤干细胞逐渐引起人们的关注。乳腺癌干细胞是一群具有自我更新、高度致瘤性的多潜能细胞,处于细胞等级的顶端,一般情况下处于静止状态,很少分裂。当分裂时,通常以不对称分裂的方式进行,产生一个新的静止的干细胞,同时产生一个分裂活跃的子细胞。乳腺癌的发生发展、转移、复发及治疗抵抗都与其有着密切联系。在乳腺癌的临床治疗中,只有靶向消除乳腺癌干细胞才是从根源上治愈乳腺癌的方法。因此,研究乳腺癌干细胞的生物特性和表型,并针对乳腺癌干细胞采取相应的治疗措施,对乳腺癌的治疗,尤其对内分泌治疗和靶向抗Her-2治疗均不敏感的三阴性乳腺癌具有重要意义。噬菌体随机肽库及其筛选技术是一种寻找高特异性蛋白分子的技术,将随机多肽与噬菌体的衣壳蛋白进行融合,在病毒颗粒表面排列表现为极高的序列多样性,与靶分子进行淘选后可以快速得到与靶蛋白相互作用的多肽或氨基酸序列,已广泛应用于肿瘤靶向治疗、肿瘤诊断标志物等研究。利用噬菌体肽库筛选肿瘤细胞,可以得到能与其特异性结合的多肽片段,本研究选用了人源性普通乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7细胞系,通过“无血清-有血清”交替培养法分别富集其中的乳腺癌干细胞,流式细胞术进行验证分选后,利用噬菌体随机肽库对富集到的乳腺癌干细胞分别进行多轮筛选,得到能够分别与MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞特异性结合的阳性噬菌体,进行扩增并测序。之后根据测序结果合成多肽,以FITC进行标记,体外细胞实验及动物实验体内分别验证多肽与乳腺癌干细胞结合的特异性,为进一步寻找乳腺癌新型标记物,及靶向治疗乳腺癌干细胞提供基础的理论依据。材料与方法:人乳腺正常细胞系hs578bst、人源性MCF-7细胞系、人源性乳腺癌MDA-MB-231 细胞系均由天津医科大学附属肿瘤医院免疫学国家重点实验室保存并提供。所用宿主菌E.coli ER2738、噬菌体随机肽库(Ph.D-12TM Phage Display PeptideLibrary)购自New England Biolabs公司;胰酶、胎牛血清、DMEM培养基等购自Hyclone公司;M13噬菌体质粒提取试剂盒购自Biomiga公司;HRP-antiM13噬菌体抗体购自GE公司;ELISA染色试剂等购自武汉默沙克生物科技有限公司;ALDEFLUOR Kit 购自 STEMCELL Technologies公司。选取人源性乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231,使用含有10%胎牛血清和双抗的DMEM培养液进行常规培养后,将B27、bFGF和EGF三种生长因子添加到无血清培养基中,以此培养并富集普通乳腺癌细胞当中的干细胞,每两三天离心换液,每无血清培养七天后,有血清培养一代以去除死细胞,如此“无血清-有血清”培养法交替,之后置于显微镜下,注意观察干细胞微球体形成情况,以能够最大程度成功富集到乳腺癌干细胞。以CD44+CD24-/lowESA+、ALDH+分别作为乳腺癌干细胞的细胞表型,流式细胞仪鉴定乳腺癌干细胞的富集情况。使用噬菌体随机肽库对富集到的乳腺癌干细胞进行多轮筛选,每一轮筛选后都要注意洗脱噬菌体,对筛选产物进行扩增和滴定后,进入下一轮筛选。ELISA检测法对阳性噬菌体鉴定和测序后,随机挑取10个阳性蓝色噬菌斑,用于后续的实验测序。将选中的阳性噬菌体进行克隆扩增,应用M13噬菌体质粒试剂盒提取DNA,送上海微基生物科技有限公司测序,根据测序结果合成多肽。将合成的多肽用FITC标记,分别与人普通乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞共同孵育,在荧光显微镜(FITC使用490nm激发波长,Hochst33258使用346nm激发波长)下进行观察拍照。之后建立BALB/c-nu裸鼠动物移植瘤模型,将MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞分别接种于裸鼠右后肢皮下组织,在局部形成原发癌,再将合成多肽通过尾静脉注入裸鼠动物体内,解剖裸鼠,检测多肽在裸鼠体内肿瘤组织和对照肝脏组织的分布情况。结果:“无血清-有血清”法交替培养普通乳腺癌细胞,经过三轮交替培养后,可以观察到培养液中形成大量悬浮的干细胞微球体,呈不规则圆球状,并随时间延长逐渐增大增多,将其传代至有血清培养基中后可见贴壁生长。以CD44+CD24-/lowESA+为乳腺癌干细胞的表型,流式细胞仪进行鉴定,可见MDA-MB-231和MCF7干细胞诱导比例,分别为77.7%和82.2%。以ALDH+作为乳腺癌干细胞的表型标记,流式细胞仪进行鉴定,可见MDA-MB-231和MCF7干细胞诱导比例,分别为 75.8%和 58.7%。噬菌体随机肽库经过与普通乳腺癌细胞系的减性筛选,以及与乳腺癌干细胞的亲和筛选,进行3轮筛选后可得到近200倍富集的噬菌体。与MDA-MB-231乳腺癌干细胞筛选后可得到8个阳性噬菌体序列,与MCF7乳腺癌干细胞筛选后可得到6个阳性噬菌体序列。从中针对MDA-MB-231乳腺癌干细胞随机选取B8进行测序,根据测序结果,合成多肽,命名为多肽B8,同时选取对照多肽为B11。针对MCF7乳腺癌干细胞随机选取A3进行测序,根据测序结果,合成多肽,命名为多肽A3,同时选取对照多肽为A13。对所得阳性多肽和对照多肽均以FITC标记。将多肽B8和A3分别与普通乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞共孵育后,荧光显微镜(FITC使用490nm激发波长,Hochst33258使用346nm激发波长)下进行观察拍照,可见合成多肽B8可与MDA-MB-231乳腺癌干细胞特异性结合,同时,合成多肽A3可与MCF7乳腺癌干细胞特异性结合。以乳腺癌干细胞MDA-MB-231和MCF7成功建立裸鼠动物模型,将合成多肽B8和A3通过尾静脉注射分别注入裸鼠体内,解剖裸鼠,可见多肽B8和A3在肿瘤组织中的分布明显高于对照肝脏组织。结论:利用噬菌体随机肽库成功筛选出能够与MDA-MB-231和MCF7乳腺癌干细胞特异性结合的多肽,为乳腺癌干细胞的靶向治疗和进一步深入研究提供基础理论依据。
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