桂枝茯等胶囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍和桃仁五味中药组成,具有活血化瘀、消癥的功效,主要用于治疗痛经、闭经、子宫内膜异位症等病。各单味药在生产加工中的成分变化研究已屡见不鲜,但基于桂枝茯苓胶囊中原药材及其复方在体内过程中的质量标志物系统化研究甚少。本文拟从产地、采收期、干燥方式及原发性痛经模型大鼠给药后吸收、药动学、代谢、排泄等方面,系统、全面地研究桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮及白芍三味药材的质量标志物。第一章文献研究本章对桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮及白芍单味药材的质量标志物在生产过程及体内过程中的变化进行了系统研究,为控制药材质量、制定标准及临床应用提供理论依据。第二章茯等、牡丹皮和白芍药材生产过程中质量标志物的影响因素研究第一节茯苓药材生产过程中质量标志物的影响因素研究(一)产地对茯苓药材质量标志物的影响研究建立LC-MS/MS测定三个产地茯苓药材中8种三萜酸类成分含量的方法,发现去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C及去氢茯苓酸为湖北罗田、安徽岳西及云南丽江产茯苓的差异性成分。(二)采收期对茯苓药材质量标志物的影响研究2018年9月10日～2018年12月10日,从湖北罗田收集了共6批药材,按照药典加工干燥后,通过LC-MS/MS方法测定8种三萜酸类成分含量,发现:各三萜酸中茯苓酸含量最高;去氢土莫酸在9月初含量最高,茯苓酸和去氢茯苓酸在10月初含量最高。(三)干燥对茯苓药材质量标志物的影响研究从湖北罗田收集一批新鲜茯苓药材,针对切制规格、发汗时间、发汗温度、干燥温度及二次发汗再干燥设计正交实验,干燥至水分合格为止,通过LC-MS方法测定8个三萜酸含量,发现切制规格、发汗时间、发汗温度及干燥温度对茯苓中的质量标志物含量影响不大,仅切制规格和发汗影响了茯苓的干燥时间及外观性状。第二节牡丹皮药材生产过程中质量标志物的影响因素研究(一)产地对牡丹皮药材质量标志物的影响研究建立不同产地牡丹皮药材指纹图谱,发现安徽五里镇、铜陵、十八里镇及十九里镇产牡丹皮药材差异明显,并通过UPLC-QTOF/MS鉴定了 12个化合物。通过含量测定,发现安徽十八里镇产牡丹皮中丹皮酚含量最高,十九里镇产牡丹皮中没食子酸、芍药苷和苯甲酰芍药苷含量最高。(二)采收期对牡丹皮药材质量标志物的影响研究2018年7月30日～2018年10月30日,从安徽十八里镇收集了 10批不同采收时间的牡丹皮药材,按照药典加工干燥后,测定没食子酸、芍药苷、苯甲酰芍药苷及丹皮酚含量,发现:8月10日～9月20日及10月10日～10月30日牡丹皮样品中活性成分含量较高,其中10月30日左右采收的样品丹皮酚含量最高。(三)干燥对牡丹皮药材质量标志物的影响研究从安徽十八里镇收集了一批新鲜牡丹皮药材,分别采用3种现代不同干燥方式(热风、红外、微波)下4个不同干燥温度(40℃、50℃、60℃和70℃)、及晒干、阴干处理,干燥至水分合格为止。采用UPLC-TQ/MS技术测定牡丹皮中酚及酚苷类、单萜苷类、有机酸类、黄酮类、鞣质类、苯丙素类等16个成分含量,发现酚类成分含量变化最大;随着温度升高,丹皮酚含量先升高后降低;单萜苷含量:红外>微波>热风;在40℃～60℃干燥时,没食子酸含量较高;晒干后,槲皮素及儿茶素含量下降最多;干燥后,五没食子酰葡萄糖含量降低。第三节白芍药材生产过程中质量标志物的影响因素研究(一)产地对白芍药材质量标志物的影响研究通过指纹图谱研究四川、河北、河南、山西和安徽5个主要产地白芍样品。利用UPLC-QTOF/MS鉴定出10个化学成分。初步发现在峰2、峰6(没食子酸乙酯)、峰10(Galloy paeoniflorin)、峰12(苯甲酰芍药苷)的含量上存在差异。并测定了白芍中6种化学成分的含量,发现:四川中江产白芍中芍药苷的含量最高,山西古县产白芍中芍药内脂苷和苯甲酰芍药苷的含量最高。(二)采收期对白芍药材质量标志物的影响研究2018年7月30日～2018年10月20日,从安徽十八里镇收集了 9批不同采收时间的白芍药材,按照药典加工干燥后,测定3种成分(没食子酸、芍药苷及苯甲酰芍药苷)含量,发现:8月30日左右采收的芍药苷含量最高。(三)干燥对白芍药材质量标志物的影响研究从安徽十八里镇收集新鲜白芍药材,通过不同加工方式(是否煮制、是否去皮)、不同干燥方式(热风、红外、微波)、不同干燥温度(40℃、50℃、60℃及70℃)处理后,采用UPLC-TQ/MS测定白芍药材中各成分的含量,发现:煮制后,芍药苷、芍药内脂苷和苯甲酰芍药苷含量均增加;去皮后,没食子酸、五没食子酰葡萄糖含量增加,苯甲酸含量降低;热风60℃干燥时芍药苷含量最高。第三章基于体内过程的桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮和白芍药材的质量标志物研究第一节桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮及白芍药材质量标志物的代谢研究采用超高效液相色谱-线性离子阱-静电轨道阱串联质谱联用(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)的方法,对大鼠灌服桂枝茯苓胶囊混悬液后的血浆、胆汁、尿液和粪便进行分析,利用质量亏损过滤(MDF)技术进行代谢产物鉴定分析。最终共鉴定出6个原型成分(没食子酸、丹皮酚原苷、芍药苷、丹皮酚、去氢土莫酸、茯苓酸)和56个代谢产物,在体内主要发生Ⅰ相代谢反应(脱羧、水解、脱羟基和脱水等)及Ⅱ相代谢反应(甲基化、乙酰化、磺化、甘氨酸或谷胱甘肽结合等)。第二节桂枝茯苓胶囊中茯等、牡丹皮及白芍质量标志物的药动学研究为研究桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮和白芍药材中质量标志物在空白和原发性痛经大鼠体内的药动学过程,利用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS建立了同时测定血浆样品中9种化学成分的方法,并在前期代谢产物鉴定的基础上,建立了其半定量方法。发现:与空白大鼠相比,模型大鼠体内的丹皮酚、丹皮酚新苷、芍药内脂苷及氧化芍药苷的Cmax显著升高,茯苓新酸A、去氢土莫酸的C max显著降低;丹皮酚、丹皮酚新苷、丹皮酚原苷、没食子酸、芍药内脂苷及氧化芍药苷的药时曲线下峰面积(AUC(O-t)显著升高。第三节桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮及白芍质量标志物的肠吸收研究研究不同浓度桂枝茯苓胶囊内容物的吸收,发现:没食子酸、茯苓酸、去氢土莫酸、茯苓新酸A、丹皮酚新苷、芍药苷、芍药内脂苷、丹皮酚、氧化芍药苷在大鼠肠中的吸收速率常数无显著性差异(P>0.05),提示各成分通过被动扩散方式进入体循环;在同一浓度下比较不同成分的肠吸收速率常数,发现:丹皮酚及没食子酸的吸收速率常数较大,可能由于它们分子结构简单,易于透过细胞膜而被动吸收。研究桂枝茯苓胶囊内容物在不同肠段中的吸收,发现茯苓酸、去氢土莫酸及氧化芍药苷的吸收部位主要在结肠,而没食子酸、茯苓新酸A、丹皮酚新苷、芍药苷、芍药内脂苷及丹皮酚在不同肠段的吸收参数无显著性差异(P>0.05),提示这些成分在模型大鼠全肠段均有吸收,无特异吸收部位。对中浓度下12个成分的吸收速率常数进行分析,发现没食子酸在十二指肠、空肠和回肠的吸收速率均大于其它成分,丹皮酚在十二指肠和空肠的吸收仅次于没食子酸。分别比较各成分在空白和模型大鼠十二指肠中的吸收速率常数,发现模型大鼠,没食子酸、丹皮酚新苷及氧化芍药苷在十二指肠中的吸收速率升高,而丹皮酚在十二指肠中的吸收速率降低。分别比较各成分在有无抑制剂条件下,十二指肠中的吸收速率常数,发现在肠灌流液中加入抑制剂后,没食子酸、去氢土莫酸、丹皮酚新苷、芍药苷及丹皮酚之间的吸收速率常数有显著性差异(P<0.05)。加P-gp抑制剂后,没食子酸、芍药苷和丹皮酚的含量显著降低,而去氢土莫酸及丹皮酚新苷的含量显著升高。因此,推测去氢土莫酸及丹皮酚新苷可能为P-gp的底物。第四节桂枝茯苓胶囊中茯苓、牡丹皮及白芍质量标志物的排泄研究对大鼠灌服桂枝茯苓胶囊后,分析大鼠胆汁、尿液和粪便样品,并计算累计排泄量和累积排泄率。发现去氢茯苓酸、猪苓酸C、牡丹皮苷C、芍药苷主要通过胆汁排泄;丹皮酚、没食子酸、芍药内脂苷主要通过尿液排泄;茯苓酸、去氢土莫酸、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷主要通过粪便排泄。