Depdc5基因敲除导致的mTORC1信号通路持续激活在酒精性肝病中的作用及分子机制研究

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背景:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,根据组成成分及作用的不同可以分为两类复合体:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(Mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(Mammalian target of rapamycin Complex 2,mTORC2)。mTORC1信号通路的调节由两类小G蛋白介导,RHEB(Ras homolog,mTORC1 binding)和RAG GTPases。TSC(Tuberous sclerosis complex)和GATOR1(GAP activities towards Rags 1 complex)通过它们所具有的GTPases的功能,分别调节RHEB和RAG GTPases的活性。TSC复合物由TSC1、TSC2和TBC17组成,介导着mTORC1信号通路对生长因子及能量信号的响应;而GATOR1,由DEPDC5(DEP domain–containing protein 5,GATOR1 complex unit)蛋白,NPRL2(NPR2 like,GATOR1 complex subunit)蛋白和NPRL3(NPR3 like,GATOR1 complex subunit)蛋白构成,调控着mTORC1信号通路对于氨基酸以及应激信号的响应。DEPDC5作为GATOR1的重要组成成分之一,能结合Rag蛋白并抑制其活性,从而介导着GATOR1复合物对于mTORC1信号通路的抑制作用。人类DEPDC5基因的突变能够引起mTORC1信号通路的持续激活并引发多种疾病,比如癫痫,胃肠间质瘤等。肝脏不仅是机体调控糖类和脂质代谢的重要器官,也是酒精在体内代谢的最主要的器官。酒精在肝细胞内主要通过乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase,ADH)氧化成乙醛,进而通过乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)氧化成乙酸。酒精在体内的氧化代谢产物能影响一系列的细胞生理反应,比如乙醛的累积会导致氧化应激甚至导致肝细胞死亡。mTORC1信号通路是肝细胞中调控脂质代谢、氧化应激等最重要的通路之一,对于维持肝脏正常的代谢稳态起着极其关键的作用。但mTORC1信号通路在肝细胞中的作用非常复杂,其激活或抑制都会导致肝细胞内代谢状态紊乱从而引起肝脏损伤,其在酒精性肝病(Alcohol-related liver disease,ALD)中的作用目前研究报道较少。DEPDC5蛋白作为mTORC1抑制因子GATOR1的重要成员,在酒精性肝病中的作用目前也尚待研究。目的:研究肝细胞中DEPDC5在酒精性肝病中的作用及相关分子机制,进一步完善mTORC1通路在调节酒精导致的肝损伤中的功能,为mTORC1通路作为治疗酒精性肝病等慢性肝损伤疾病提供理论基础。方法:1.选取2-3月龄C57BL/6J小鼠,建立ALD小鼠模型;从C57BL/6J小鼠肝脏分离原代肝细胞,培养后进行酒精刺激实验;获取人类酒精性肝炎肝脏样本。从细胞实验、动物实验、人体实验角度研究酒精刺激与mTOR信号通路的关系。2.通过将Depdc5flox/flox小鼠与Albumin-Cre小鼠进行交配,获得肝细胞Depdc5基因特异性敲除Depdc5flox/flox;Alb-Cre小鼠,即LKO小鼠(Depdc5 gene liver conditional knockout mouse)。选取2-3月龄小鼠,分析Loxp和LKO小鼠体重,肝重,组织学,肝脏生化等。3.选取2-3月龄Loxp和LKO小鼠,建立酒精性肝病小鼠模型及对照模型,即AF-LKO(Alcohol-fed LKO)和AF-Loxp(Alcohol-fed Loxp)小鼠。分析AF-LKO小鼠mTOR信号的表达,并分析AF-LKO小鼠血清生化、体重、肝重、组织病理学、炎症反应、肝脏纤维化、细胞自噬、内质网应激和线粒体损伤等指标。4.利用shRaptor及对照shGFP腺病毒行AF-Loxp和AF-LKO小鼠尾静脉注射,产生肝脏特异性RAPTOR敲低,检测RAPTOR敲低对AF-LKO小鼠肝脏mTOR信号及肝脏组织学和肝功能的影响。5.利用mTOR抑制剂Torin1行AF-Loxp和AF-LKO小鼠腹腔注射,研究mTOR抑制剂对肝脏mTOR信号及肝脏组织学和肝功能的影响。6.通过逆转录-聚合酶链反应、转录组测序技术、透射电镜等技术,分析AF-LKO小鼠脂质合成、脂质摄取、脂肪酸氧化,极低密度脂蛋白分泌等脂质代谢过程关键基因的m RNA表达,筛选出促进脂质合成的关键通路及关键基因。7.利用PPARα激动剂Fenofibrate激活AF-Loxp和AF-LKO小鼠PPARα通路,研究Pparɑ基因在AF-LKO小鼠ALD发生发展中的作用和机制。8.利用Ad-DEPDC5和Ad-GFP腺病毒行C57BL/6J小鼠尾静脉注射,研究DEPDC5蛋白过表达对肝脏mTORC1信号通路的影响。结果:1.酒精刺激激活C57BL/6J小鼠原代肝细胞、C57BL/6J小鼠及人类酒精性肝炎患者肝脏的mTORC1信号通路,KLHL22蛋白水平增加,DEPDC5蛋白水平下降。2.成功繁育并筛选出Depdc5基因肝细胞特异性敲除小鼠LKO。2-3月龄LKO小鼠肝脏mTORC1信号通路被持续激活,3区肝细胞体积增大,肝功能下降,肝脏脂肪含量未变。3.AF-LKO小鼠肝脏mTORC1信号持续过度激活,肝损伤和脂肪变性、氧化应激及炎症反应加重,内质网应激增加,自噬减弱并出现线粒体损伤等改变。4.通过shRaptor腺病毒能够敲低AF-LKO小鼠肝脏RAPTOR蛋白并抑制mTORC1活性,挽救AF-LKO小鼠的肝脏脂肪变性。5.通过mTOR抑制剂Torin1处理能够适度抑制AF-LKO小鼠mTORC1活性,显著改善AF-LKO小鼠的肝脏脂肪变性及炎症反应。6.AF-LKO小鼠肝脏脂质和脂肪酸氧化相关通路基因的表达下调;脂肪酸氧化PPARα通路相关基因的表达显著下调,提示肝细胞脂肪酸氧化水平下降是引起AF-LKO小鼠肝脏酒精性脂肪堆积的主要原因。7.通过PPARα激动剂Fenofibrate可显著激活AF-LKO小鼠肝脏PPARα信号通路,挽救AF-LKO小鼠的肝损伤、肝脏脂肪变性和炎症反应。8.通过腺病毒过表达DEPDC5蛋白未能抑制酒精喂养C57BL/6J小鼠mTORC1信号通路及肝脏脂肪变性。结论:肝细胞特异性敲除Depdc5能够持续激活mTORC1通路,导致肝损伤、炎症反应的发生。LKO小鼠在酒精刺激下却有较Loxp小鼠更为严重的酒精性脂肪肝,同时也有更明显的炎症反应及氧化应激压力。ShRaptor腺病毒介导Raptor基因在肝脏的敲除能显著缓解LKO及Loxp小鼠中酒精刺激产生的肝脂堆积,但却因为持续的mTORC1通路失活而导致肝脏损伤增加。Torin1处理对mTORC1通路的药理学抑制相对较弱,却能挽救Depdc5敲除及酒精刺激所导致的所有肝脏病理异常,说明mTORC1通路持续激活是导致LKO小鼠在酒精刺激下呈现更为严重的肝脏病理变化的原因,维持mTORC1活性适度对于维持肝脏正常的生理稳态是非常关键的因素。通过RNA-seq的研究揭示了脂肪酸氧化PPARα通路的基因表达的下调,提示Depdc5敲除和刺激协同抑制了PPARα的活性,减弱了脂质氧化并导致线粒体损伤。而PPARα的激动剂Fenofibrate处理小鼠能基本挽救Depdc5敲除引起的肝脏脂肪变性、损伤及炎症,说明持续激活的mTORC1通过抑制PPARα的活性,从而导致了酒精刺激下的肝脏病理性改变。此外,腺病毒介导DEPDC5在肝脏中的过表达并不能增加GATOR1的活性,因此不能抑制酒精所导致的mTORC1通路的激活,也没有改变酒精刺激下肝脏病理异常。
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