第一部分非嗜酒性韦尼克脑病的临床研究目的:增加临床医师对非嗜酒性韦尼克脑病(Wernicke’s encephalopathy,WE)临床特点的认识、评价颅脑MRI的临床诊断价值,提高早期诊断率、减少误诊误治的发生。方法:对12例非嗜酒性WE患者的临床表现、颅脑MRI特征进行分析和随访研究。12例患者均出现明显中枢神经系统症候,其中首发表现为头晕5例、嗜睡2例、表情淡漠3例、记忆障碍3例、行走不稳3例、精神异常2例、复视1例、视力减退1例。疑诊为WE时的神经系统体检发现眼球震颤7例、意识障碍10例(嗜睡1例、昏睡3例、浅昏迷4例、深昏迷2例)、记忆力减退3例、眼球运动障碍4例、共济失调3例、精神异常2例、复视1例、双眼视力下降1例。所有患者中,具有眼球震颤或/和运动障碍、共济失调及全脑功能障碍典型三联征表现者2例,3例患者仅有意识障碍而始终缺乏局灶性神经系统定位体征。所有患者均在疑诊WE时立即行颅脑MRI(T1W和T2W成像)检查、协助诊断并排除脑血管疾病等诊断,其中10例患者加做Flair成像检查、4例患者加做DWI检查、3例患者(1例嗜睡、2例浅昏迷)加做T1W增强扫描。首次颅脑MRI检查距首发中枢神经系统表现时间为7.25±3.14d(3～14d)。一旦怀疑WE,立即给予大剂量硫胺素静脉或肌肉注射治疗:首日200～500毫克,以后每日100mg,连续1个月或至死亡为止,治疗1个月后或随访期间每日给予呋哺硫胺150毫克、分次口服。所有患者每3月随访神经系统体检和颅脑MRI检查1次,直至症候完全消失、MRI责任病灶消失或病情稳定无变化,其中1例因死亡未能随访颅脑MR检查,2例患者失访。结果:WE患者疾病严重程度与其脑部组织损害范围相关:2例深昏迷患者不仅显示对称性内侧丘脑、尾状核头部、第Ⅳ脑室底部及第Ⅲ脑室、中脑导水管等周围脑组织异常信号,其部分大脑皮质也明显对称性受累,其中以运动皮质对称性受累最为明显;7例患者于颅脑MR检查时处于浅昏迷或昏睡状态,MRI表现为对称性内侧丘脑、第Ⅳ脑室底部及第Ⅲ脑室、中脑导水管周围等脑组织明显损害,T1W成像等信号,T2W、FLAIR与DWI成像高信号,其中2例浅昏迷患者伴有尾状核头部损害;颅脑MRI检查时2例意识清醒患者及1例嗜睡患者仅显示中脑导水管周围与第Ⅳ脑室底部损害。所有患者均未见小脑蚓部与乳头体萎缩。3例增强扫描的患者中,2例(嗜睡与浅昏迷各1例)可见乳头体明显强化,显示部分患者乳头体急性损害;1例嗜睡患者显示第Ⅳ脑室底部轻度强化。1例中脑导水管周围损害的患者伴有不典型双侧红核损害。伴有大脑皮质损害的WE患者业已处于脑组织损害的不可逆期,预后恶劣:1例患者于诊断WE 15d后死亡,1例患者成为永久植物状态、其颅脑MRI随访两年,显示对称性内侧丘脑、皮层及中脑导水管等周围异常信号一直存在并伴全脑进行性萎缩;仅显示内侧丘脑、第Ⅳ脑室底部及第Ⅲ脑室、导水管周围等脑组织损害的患者,其中枢神经系统损害仍然是可逆的:10例患者经静脉或肌肉注射硫胺素1～7d后,其临床症候显著好转。除2例患者失访,8例患者颅脑MRI随访3-12个月,临床症候与颅脑MRI异常信号逐渐消失。结论:1、大多数非嗜酒性WE患者临床表现与病程不典型,仅少数患者具有眼球运动障碍、共济失调和全脑功能错乱等“三联征”的典型表现,容易被误诊;2、为了减少误诊,无论是否具有嗜酒背景,在禁食、厌食、频繁呕吐等可疑硫胺素缺乏(thiamine deficiency,TD)情况下出现头晕、共济失调、眼球震颤、眼球运动障碍、记忆与意识障碍等临床表现,尤其是急性记忆与意识障碍即应怀疑WE可能。3、颅脑MRI不仅对非嗜酒性WE的诊断具有特异性价值,对其病程和预后判断也具有显著价值:(1)如颅脑MR检查出现对称性内侧丘脑、第Ⅳ脑室底及第Ⅲ脑室、中脑导水管周围等脑组织的损害表现,则可基本明确诊断为WE,乳头体均匀强化有助于进一步确立诊断。(2)内侧丘脑、第Ⅳ脑室底、导水管周围等对称性损害是WE典型的MRI表现,患者大多表现为昏睡或浅昏迷等较为明显的意识障碍;仅有第Ⅳ脑室底和导水管周围损害的患者大多意识障碍较轻(如嗜睡)或没有意识障碍;而伴有运动区皮质损害的患者呈现深昏迷状态;(3)仅有内侧丘脑、第Ⅳ脑室底、导水管周围等对称性损害的非嗜酒性WE是可逆性的,而一旦伴有皮质损害则预示其病变不可逆性、预后极其恶劣。4、尾状核头部和皮质的累及并非非嗜酒性WE的不典型表现,而是其病理损害进展的标志之一;5、与文献报道的乙醇中毒性WE患者不同,除2例深昏迷伴有运动区皮质损害的患者预后恶劣外,本组其余非嗜酒性WE患者经适当治疗均能完全治愈、不遗留后遗症。第二部分非嗜酒性硫胺素缺乏和韦尼克脑病实验研究之模型建立目的:建立非嗜酒性硫胺素缺乏(thiamine deficiency,TD)和韦尼克脑病小鼠模型,探索其常规病理学、超微病理变化、胆碱能神经元和行为学变化的时间规律和分期。方法:利用单纯饮食剥夺及饮食剥夺硫胺素结合吡啶硫胺腹腔注射两种方法制作非嗜酒性TD小鼠模型。用Y迷宫检测TD模型小鼠第2、9、16和20天的学习能力及随后5天即TD第7、14、21和25天的记忆能力。对出现学习或/和记忆能力下降的模型小鼠行H-E、Nissl染色及胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫组化染色、电子显微镜检查,并且给予硫胺素补充治疗,观察行为学的变化。结果:两种模型制备方法均从TD第9天开始,模型小鼠出现学习能力的下降,单纯TD模型从第21天开始出现记忆能力的下降。TD第9天时,无论是单纯TD还是结合腹腔吡啶硫胺注射小鼠模型,H-E和Nissl染色、电子显微镜检查均未发现海马、丘脑、乳头体等部位的病理变化和线粒体等细胞器异常,免疫组化研究显示膈核ChAT免疫阳性细胞数目并未减少;TD结合吡啶硫胺腹腔注射模型从第13-14天开始,海马、丘脑、乳头体等部位出现灶性出血性病理变化和膈核ChAT免疫阳性细胞数目减少,新皮质未见病理变化和线粒体等细胞器,其模型动物出现典型的反正反射消失等行为学异常;而单纯TD模型至21天时才部分动物出现海马、丘脑、乳头体等部位出现灶性出血性病理变化和膈核ChAT免疫阳性细胞数目减少,所有模型动物均未见反正反射消失。在单纯TD9天时,给予腹腔注射硫胺素12小时后,模型小鼠学习能力可以完全逆转;而在TD16天时,给予补充硫胺素则不能逆转模型小鼠学习与记忆能力下降。结论:1、本部分实验证明,通过单纯饮食剥夺硫胺素或饮食剥夺硫胺素结合腹腔注射吡啶硫胺能够稳定制备非嗜酒性TD和WE小鼠模型,海马、丘脑等脑区为TD易损脑区,新皮质为非易损脑区;2、饮食硫胺素剥夺结合腹腔注射吡啶硫胺制作的非嗜酒性TD和WE小鼠模型从13-14d开始在内侧丘脑等部位出现特征性对称性的灶性出血等病理损害,与临床影像学观察结果一致;而单纯TD模型较少出现类似于临床的典型病理变化,但病理损害前期向病理损害移行的间隙期和动物存活期均较长;3、非嗜酒性TD动物在病理损害前期(TD9d)即开始出现学习能力的下降,此时大剂量硫胺素的补充可显著逆转下降的学习能力。显然,现有的关于丘脑—乳头体—海马神经环路的病理损害或脑胆碱能神经元的缺失而导致认知功能下降的说法无法解释TD9时出现的学习能力的下降。第三部分非嗜酒性硫胺素缺乏和韦尼克脑病实验研究之病理机制研究(一)病理损害前期硫胺素缺乏对海马突触长时程增强的影响目的:研究TD病理损害前期海马CA1区和CA3区突触长时程增强(LTP)的变化,探讨病理损害前期的TD对海马以谷氨酸为递质的兴奋性神经通路突触可塑性的影响。方法:细胞外场电位记录分别在海马CA1区域和CA3区域进行。诱导CA1区LTP时,刺激电极和记录电极沿CA3到CA1走向依次放在CA1区放射层的Schaffercollateral通路;诱导CA3区LTP时,刺激电极置于mossy fiber bundle,记录电极置于stratum lucidum。结果:在海马CA1区和CA3区,TD组和正常组都可以经TBS诱导出LTP,TD组与对照组图形相似,数据统计后未发现统计学差异。结论:TD病理损害前期的海马CA1和CA3区LTP未见变化,显示海马以谷氨酸为递质的兴奋性神经通路的突触可塑性与TD病理损害前期的学习能力下降可能无关。(二)病理损害前期硫胺素缺乏对海马神经发生的影响目的:探讨TD对海马齿状回颗粒下层神经发生的影响及其与TD导致的认知功能异常的关系。方法:用BrdU、PCNA、Dcx、NeuN等抗体免疫组化染色及BrdU和NeuN双标记染色,研究TD第7、9、14和25天模型小鼠海马齿状回颗粒细胞下层神经发生功能,以及硫胺素补充治疗试验对海马齿状回颗粒下层神经发生的影响。结果:从TD第9天起,小鼠海马齿状回BrdU、PCNA、Dcx阳性细胞数或免疫活性较正常对照组显著减少,且BrdU阳性细胞的存活率和BrdU与NeuN双标记阳性神经元数目也显著下降,而NeuN阳性神经元的免疫活性则无明显变化。此时给予硫胺素注射5天后,海马BrdU和Dcx免疫阳性细胞较未补充前显著增加,而在TD16天时给予补充硫胺素则不可逆转下调的海马神经发生功能。结论:TD早期即显著下调海马神经发生功能、而对成熟神经元影响不大;在TD病理损害前期,海马神经发生功能的受损是可逆的,而TD晚期则属于不可逆期。(三)非嗜酒性硫胺素缺乏对硫胺素作为辅酶的相关酶活性和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP~+、NADPH)影响的研究目的:研究TD对脑内硫胺素作为辅酶的丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、转酮醇酶活性的影响,探讨它们与TD导致的特异性脑区损害和认知功能障碍发生机制之间的关系。材料与方法:根据前述方法、饮食剥夺硫胺素制备TD小鼠模型,实验分TD9、TD14、TD21和正常对照4组,每组5只小鼠。水合氯醛麻醉后断头处死小鼠并迅速取出大脑。依据Stephan方法提取线粒体,BCA法测定线粒体蛋白浓度。依据Humphries等人的方法测定α-酮戊二酸脱氢酶活性,依据Hinman等人的方法测定丙酮酸脱氢酶活性,依据文献业已报道的方法测定脑组织转酮醇酶活性和NADP~+、NADPH的含量,并计算NADP~+/NADPH比例。每组活性检测重复三次,所有数值表示为mean±SEM,用t检验统计对照组和TD9、TD14、TD21组有无统计学差异。结果:TD对小鼠大脑丙酮酸脱氢酶活性的影响并不明显:与正常对照组相比,TD9组、TD14组和TD21组全脑组织匀浆测定丙酮酸脱氢酶活性分别为99.63±1.88%、95.12±1.22%和95.07±0.76%,无统计学差异(P>0.05);正常对照组、TD9组、TD14组和TD21组的α-酮戊二酸脱氢酶活性分别为99.20±1.91%、91.45±1.24%和88.34±1.53%,TD9组和TD14组与正常对照组相比无统计学差异(P>0.05),TD21组较正常对照组酶活性显著下降(P<0.05);正常对照组、TD9组和TD14组的TK活性分别为10.90±0.67、10.46±0.94和9.19±1.84U/克蛋白,TD14组与正常对照组相比有显著性差异(P<0.05),TD9组与正常对照组比较,无统计学差异;正常对照组、TD9组和TD14组的NADP~+分别为20.22±3.67、17.89±3.54和18.45±2.54pMol/L,无统计学差异,NADPH及NADP~+/NADPH分别为9.37±1.57、7.17±0.73、7.43±1.11 pMol/L和2.17±0.21、2.49±0.34、2.49±0.10,TD9和TD14组的NADPH及NADP~+/NADPH均较正常对照组显著下降(P<0.05)。结论:目前学术界普遍接受的、与丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性相关的能量代谢障碍、氧化损伤机制难以全面解释TD导致的脑中线两侧组织特异性损害和认知功能障碍的发生机理;转酮醇酶活性下降导致的磷酸戊糖代谢通路功能障碍、致使NADPH、核糖和核苷酸合成减少可能参与了硫胺素相关的脑中线两侧特异性脑区损害机制。