多糖裂解单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)是近期发现的一类功能性多糖氧化水解酶,其催化活性中心由两个组氨酸和一个Cu2+构成,可氧化裂解纤维素、几丁质、淀粉等不溶性多糖底物,生成寡聚糖醛酸。如何高效、环保的生产出在医疗、农业以及食品行业有着重要应用价值的寡糖物质是本课题研究的目的所在。当今比较新兴方法是在几丁质酶降解体系中添加多糖裂解单加氧酶,辅助降解不溶性多糖,利用多糖裂解单加氧酶的氧化作用将大分子糖链打碎,便于几丁质酶的进一步降解,大大提高了反应效率。本文采用分子生物学方法,首次从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)中克隆得到一种多糖裂解单加氧酶(Bt LPMO10A),其属于氧化水解酶AA10家族。采用RF-clone技术将目的基因与载体pET22b相连接,然后导入至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,重组蛋白的分子量为20 KDa,经亲和层析柱纯化得到纯净的蛋白,在pH 8.0的Tris-HCl体系中稳定。BtLPMO10A对苹果腐烂病、西瓜枯萎病、玉米大斑病和黑曲霉四种真菌的生长无抑制活性。BtLPMO10A在pH 8.0的环境条件下对β-几丁质有较强的底物结合能力,对微晶纤维素和壳寡糖无结合作用。BtLPMO10A可以氧化降解几丁质底物,MALDI-TOF MS对Bt LPMO10A氧化作用产物分析表明,在Vc存在的条件下,BtLPMO10A可以将几丁质降解成聚合度2~11的寡糖醛酸。本研究考察了BtLPMO10A与几丁质酶的相互协同作用,通过高效液相色谱检测其主要产物是壳二糖,通过对比分析壳二糖产量发现,BtLPMO10A可以大大提高几丁质酶降解效率,壳二糖产量提高3-10倍。