论文部分内容阅读
目的:探讨不同剂量胆红素致正常人肝细胞 L-02生长及凋亡的变化。 方法:将不同浓度的胆红素(0 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)作用于体外养的正常人肝细胞L-02,用倒置显微镜观察其形态变化;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察不同浓度胆红素作用L-02细胞24h后的相对存活率的影响;不同浓度胆红素作用24h后,采用DNA琼脂糖凝胶电泳;不同浓度胆红素作用12h后流式细胞仪Annexin-V和PI双标等技术检测细胞凋亡率;将 L-02接种于6孔板中进行细胞爬片后,用同浓度胆红素作用24h,多聚赖氨酸处理玻片做免疫组化染色检测Bcl-2与Bax蛋白的表达。 结果:在倒置相差显微镜下对正常人肝细胞 L-02进行观察,对照组细胞24h形态无明显变化呈上皮型贴壁生长,细胞呈梭形或多边形,低浓度(100 mg/L、150 mg/L)胆红素作用的细胞12h内细胞细胞贴壁良好,可见黄染;高浓度(200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)胆红素作用的细胞2h内形态无明显改变,4h后可见细胞被黄染,较多细胞突起、变圆,但细胞轮廓清晰,贴壁良好;6h可见细胞轮廓不清,少数细胞漂浮于培养基中;12h可见较多细胞漂浮,并已开始崩解。MTT法显示胆红素作用后L-02细胞的生长受到抑制,各组的OD值分别是0.2251±0.0324、0.2745±0.0466、0.6412±0.0734、0.7295±0.0337、0.7629±0.0327、0.8322±0.0336。各浓度和对照组间、各浓度组见差异具有统计学意义(F=74.4644,p<0.05),除对照组与100mg/L组间比较差异无统计学意义外(q=2.464,p>0.05),其余各时间组间差异有统计学意义(p<0.05)。Hoechst33258荧光染色在各实验组均可见细胞凋亡,其中高浓度(200、250、300 mg/L)胆红素组更为明显,大量L-02细胞呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。低浓度(100、150 mg/L)胆红素组和对照组也可见少量细胞凋亡。对照组细胞琼脂糖凝胶电泳可见,DNA双链完整,相对分子质量大,滞留在加样孔附近,未形成DNA条带。胆红素溶液高浓度组(200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)出现典型的云梯状细胞凋亡的DNA ladder,随浓度增加图像更清晰、典型。流式细胞仪检测结果显示,从0mmol/L剂量组到300mmol/L剂量组,凋亡率从1.24％上升到57.3%,各组之间差异有统计学意义(p<0.05)。Bcl-2在300mg/L组偶见棕黄色颗粒状,呈散在、弱阳性表达,200mg/L组与300mg/L组相比较阳性细胞数增多,染色加深,呈黄褐色表达。Bax主要在肝细胞胞浆呈棕黄色颗粒状;对照组未见阳性表达,200mg/L组可见肝细胞散在、弱阳性表达,较150mg/L组有所增强,阳性细胞数增多,250mg/L组阳性染色进一步加深,阳性细胞多,300mg/L组肝细胞弥漫阳性染色,染色加深,阳性细胞数增多。 结论:胆红素可抑制正常成人离体肝细胞 L-02的生长并诱导其发生凋亡,呈现良好的剂量-效应关系。该凋亡的可能与Bcl-2与Bax表达发生改变有关。