贾第鞭毛虫是一种常见的肠道原虫,其宿主范围非常广泛,可引起包括人在内的多种哺乳动物腹泻,主要通过食物和水传播。贾第鞭毛虫病呈世界性分布,自20世纪70年代以来,世界各地常有贾第鞭毛虫病的流行与暴发,因贾第虫病曾在国际旅游者中流行,故被称为“旅游者腹泻”,现己列为全世界危害人类健康的10种主要寄生虫病之一。随着社会的不断发展,人与动物的关系越来越紧密,直接接触或间接接触的不断增多,一些家畜、伴侣动物和野生动物作为该原虫的保虫宿主对人类卫生健康的潜在威胁日渐增长。目前,国内对于贾第鞭毛虫的检测多为形态观察或基于PCR扩增的检测方法,前者漏检率较高,后者对于仪器的精密度要求较为严格,成本较高且用时长。本文利用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术建立了特异,高效、成本低廉的检测贾第鞭毛虫的方法,并加以应用。1.通过形态学观察和PCR检测方法鉴定了犬贾第鞭毛虫,利用PCR扩增了贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶基因(Triose phosphate isomerase, TPI)和p-贾第素基因(β-giardin),并将其克隆入pMD-19T载体,获得重组质粒pMD-19T-TPI和pMD-19T-β-giardin,用于LAMP检测方法的建立。2.基于贾第鞭毛虫TPI和β-giardin基因,设计了LAMP引物与常规PCR扩增引物,建立了LAMP检测方法,对其敏感性与特异性进行了分析。将重组质粒pMD-19T-TPI和pMD-19T-β-giardin进行倍比稀释,以稀释的质粒为模板进行LAMP与PCR方法的敏感性试验,基于TPI和β-giardin基因建立的LAMP方法所能检测到的最低DNA含量分别为1.85×10-9ng和1.65×10-9ng。常规PCR所能检测到的最低DNA含量分别为7.4×10-7ng和6.6×10-7ng。结果表明LAMP方法的敏感性是常规PCR方法的400倍。分别利用贾第鞭毛虫基因组、混合球虫基因组(柔嫩艾美尔球虫和毒害艾美尔球虫)、旋毛虫基因组、弓形虫基因组、大肠杆菌和猪链球菌基因组为LAMP反应模板,进行LAMP的特异性试验,结果仅有以贾第鞭毛虫基因组为模板的LAMP反应加入SYBR Green Ⅰ后呈现荧光绿,电泳呈阶梯状,证明本试验建立的LAMP方法具有很好的特异性。3.对69份犬与野生动物的粪便样品分别进行形态观察、常规PCR检测和LAMP检测,结果发现,形态学检测方法鉴定出8个阳性样品,检出率为11.6%；PCR检测结果为13个阳性样品,检出率为18.8%；LAMP检测结果为13个阳性样品,检出率为18.8%,与PCR检测结果一致,且高于普通镜检,能够提高检出率与检出的准确度。本研究建立的LAMP方法由于检测成本低,敏感性和特异性强,操作方便,为临床上人和动物贾第鞭毛虫病的诊断提供了新的选择。