【研究背景】　　汉滩病毒（ Hantaan virus, HTNV）感染在我国主要引起肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），该病缺乏特异有效的治疗药物，通过疫苗接种预防HTNV感染成为控制疾病发生的主要手段。病毒样颗粒（Virus like particle, VLP）是病毒生活周期中结构蛋白自我组装形成的不含病毒核酸的颗粒样物质，包括 HTNV在内的部分病毒，能够通过基因工程方法表达病毒结构蛋白合成VLP，VLP作为疫苗具有安全性高、免疫效果好的优点。在VLP表面嵌合粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）或CD40配体（CD40 ligand, CD40L）的免疫佐剂可提高其免疫效果。本实验室前期在哺乳动物细胞中成功表达了含有HTNV核衣壳蛋白（Nucleoprotein, NP）和包膜糖蛋白（Glycoprotein, GP）的 HTNV VLP，并在此基础上嵌合佐剂基因表达出 HTNV VLP-GM-CSF和HTNV VLP-CD40L。本研究旨在明确HTNV嵌合VLPs的生物学活性，并对其分别免疫小鼠后的长效免疫效果进行初步探讨，为HTNV VLP疫苗的应用提供一定的实验基础。　　【研究方法】　　三种HTNV VLPs（后文分别用VLP代表单纯HTNV VLP，VLP-GM-CSF代表嵌合GM-CSF的HTNV VLP，VLP-CD40L代表嵌合CD40L的HTNV VLP）分别与无菌分离的 C57BL/6小鼠骨髓细胞共培养，设置空白对照组，流式细胞术（Flow cytometry, FCM）检测骨髓细胞中F4/80+CD11b+细胞、CD11c+细胞的数量以及MHC-Ⅱ、CD40、CD86分子的表达情况，以评价HTNV VLPs促进骨髓细胞向抗原提呈细胞（Antigen presenting cell, APC）分化、成熟情况。经三种HTNV VLPs分别刺激的体外脾脏淋巴细胞中，以及经其分别免疫小鼠后分离的脾脏淋巴细胞中，分别检测CD4+CD25+细胞和 CD8+ CD25+细胞的数量以测定 T细胞增殖和活化情况，检测B220+CD69+细胞数量以测定B细胞增殖和活化情况。　　三种HTNV VLPs以及HTNV灭活疫苗分别免疫C57BL/6小鼠，设置生理盐水对照组，初次免疫6个月后，以相同剂量加强免疫一次，检测各实验组加强免疫前、后的体液免疫和细胞免疫效果，初步评价HTNV VLPs的长效免疫效果。间接酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunoabsordent assay, ELISA）检测抗HTNV特异性抗体水平，微量细胞中和实验检测抗HTNV中和抗体水平来评价各实验组的长效体液免疫效果；酶联免疫斑点实验（Enzyme-linked Immunospot assay, ELISPOT）测定细胞因子IFN-γ和IL-4分泌水平，细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）杀伤实验评价其长效细胞免疫效果；加强免疫前、后，分别用HTNV攻击免疫小鼠，通过双抗体夹心 ELISA法检测病毒抗原、实时定量聚合酶链反应(Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测病毒核酸、病理切片观察实验小鼠脏器病理变化来评价其长效免疫后的动物保护作用。　　【实验结果】　　FCM检测结果显示，三种HTNV VLPs分别刺激的小鼠骨髓细胞F4/80+CD11b+细胞、CD11c+细胞数量以及MHC-Ⅱ、CD40和CD86分子表达水平均明显升高，表明其有效地刺激了小鼠骨髓细胞向APC分化、成熟。三种HTNV VLPs体外分别刺激的小鼠脾脏淋巴细胞和经其免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞中 CD4+ CD25+、CD8+CD25+T细胞数量和B220+CD69+B细胞数量均明显增高，表明HTNV VLPs均有效地促进小鼠体内及体外 T、B淋巴细胞增殖和活化。其中，VLP-GM-CSF在促进骨髓细胞向APC分化成熟方面和促进小鼠体内、外T细胞增殖和活化方面作用更为明显。而在促进小鼠体内、外B淋巴细胞增殖和活化方面，VLP-CD40L的作用更为明显。　　长效体液免疫结果显示，HTNV灭活疫苗组小鼠血清中几乎未检测到抗 HTNV NP特异性抗体，且仅检测到少量的中和抗体。HTNV VLPs分别免疫的小鼠血清中抗HTNV NP特异性抗体和中和抗体水平均高于HTNV灭活疫苗组，VLP-GM-CSF和VLP-CD40L组小鼠抗HTNV NP特异性抗体与中和抗体水平高于VLP免疫组小鼠。加强免疫后，小鼠抗HTNV NP特异性抗体与中和抗体水平均比加强免疫前有所提高。长效细胞免疫结果显示，HTNV灭活疫苗组和生理盐水对照组相比，IFN-γ分泌水平相当，而三种HTNV VLPs分别免疫小鼠后，脾细胞IFN-γ分泌水平明显高于HTNV灭活疫苗组。加强免疫后，各实验组小鼠脾细胞 IFN-γ分泌水平均高于加强免疫前的水平，而且VLP-GM-CSF和VLP-CD40L免疫组小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平明显高于VLP免疫组。但各实验组小鼠脾细胞IL-4分泌水平均与生理盐水对照组分泌水平相当。各实验组小鼠CTL杀伤结果差异和脾细胞分泌的IFN-γ变化相一致。　　免疫6个月后，对各实验组小鼠进行HTNV攻击。结果显示，HTNV灭活疫苗组与生理盐水对照组小鼠部分脏器内检测到较高水平的病毒抗原和核酸，病理切片观察小鼠肝脏、肾脏和肺脏出现炎细胞浸润等病理改变。经HTNV VLPs分别免疫的小鼠组织器官中病毒抗原和核酸含量均明显低于生理盐水对照组，且未见明显的病理改变。表明HTNV VLPs分别免疫的小鼠均有效抵抗了病毒攻击，而HTNV灭活疫苗免疫组小鼠不具有抵抗病毒攻击的能力。加强免疫后，HTNV灭活疫苗免疫组和HTNV VLPs免疫组小鼠脏器中HTNV抗原和核酸载量均较生理盐水对照组明显降低，且脏器未见明显病理改变，表明加强免疫后各实验组均具有良好的动物保护作用。　　【结论】　　本课题分别对前期构建的三种 HTNV VLPs生物学活性及长效免疫效果进行了研究，发现HTNV VLPs分别在小鼠体内、外的实验中发挥良好的生物学活性。在对其长效免疫研究中发现，HTNV灭活疫苗免疫效果差，且几乎没有动物保护作用，需进行加强免疫后才具有一定的免疫效果和动物保护作用。HTNV VLPs分别具有长效免疫效果，而且VLP-GM-CSF和VLP-CD40L与VLP相比表现出更好的免疫效果，加强免疫可以增强HTNV VLPs的免疫效果。此外，经HTNV VLPs分别长效免疫的小鼠能够抵抗HTNV的攻击，具有良好的动物保护效果，表明在HTNV嵌合VLPs具有良好的应用前景。