镰刀菌属（Fusarium spp.）广泛存在于土壤和植物中,生态适应性强,能够侵染植物,感染人和动物。镰刀菌侵染植物引起枯萎病和赤霉病,给农业造成巨大经济损失。临床上镰刀菌引起浅表性感染,常见于导致真菌性角膜炎;近些年免疫力低下的人群越来越多,真菌引起的深部感染发病率逐渐升高,镰刀菌作为机会致病性真菌,在丝状真菌引起的深部感染中仅次于曲霉属（Aspergillus spp.）。目前,病原真菌的耐药机制研究多集中在假丝酵母属（Candida spp.）和曲霉属。已明确的机制有药物作用靶酶的改变、药物外排泵的过度表达、细胞膜或细胞壁成分的改变以及生物膜的形成等。在临床上,镰刀菌属于新发感染,几乎对现有的抗真菌药物如唑类、棘白菌素类及多烯类等都具有耐药性,多重耐药性已成为其防治的关键所在。而目前关于镰刀菌耐药机制的报道较少,本研究旨在寻找耐药相关基因并解析其耐药机制。本研究以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的多重耐药株为研究对象,采用根癌农杆菌介导的遗传转化（Agrobacterimu tumefaciens-mediated transformati on,ATMT）技术,对尖孢镰刀菌进行T-DNA的随机插入,从而获得突变体。前期实验室已成功建立并优化了ATMT转化尖孢镰刀菌的方法。本研究通过AT MT技术共转化获得了1120株突变体,通过PCR验证确定T-DNA插入成功且可以稳定遗传,为研究尖孢镰刀菌生长发育、致病及耐药相关基因的功能提供了足量资源。对1120株突变体进行筛选,共筛选出6株生长发育异常的突变体,为FOM159、FOM312、FOM364、FOM589、FOM977和FOM1012。通过TAIL-PCR（T hermal asmmetric interlaced PCR,热不对称交错PCR）定位其T-DNA插入位点,确定被打断的基因,分别为TIF31蛋白以及5种假定蛋白。采用伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B（Amphotericin B,AmB）以及卡泊芬净4种临床常用抗真菌药物进行药物敏感性试验发现,与野生株相比,上述6株突变体的药物敏感性无明显变化。采用上述4种药物对随机挑选的700株突变体进行筛选,发现1株突变体FOM263对AmB敏感性提高4倍,利用TAIL-PCR获得该突变体的T-DNA插入位点侧翼序列,经比对发现基因FOXG₁8528头部（925bp）、FOXG₁8529（539bp）和FOXG₀3305尾部（1174bp）被打断。为明确耐药相关基因,分别构建Δ03305和Δ018528单基因敲除株。对敲除株Δ03305和Δ018528进行药物敏感性试验,结果显示,Δ03305的药物敏感性与突变体一致。基因FOXG₀3305缺失导致菌株对AmB敏感性提高,说明FOXG₀3305与尖孢镰刀菌耐药相关。与野生型相比,Δ03305除产生较多色素外,菌落、镜下形态及生长速度与野生型无明显差异,说明基因FOXG₀3305不影响菌株的营养生长。FOXG₀3305编码假定蛋白,功能未知。氨基酸序列经NCBI比对,预测该蛋白含有2个保守结构域,分别为类似于GAL4的Zn（II）2Cys6双核簇结构域和二聚化的亮氨酸拉链结构域,推测该蛋白为Zn（II）2Cys6锌簇转录因子。在酵母类真菌中已发现大量与耐药相关的转录因子,而目前关于丝状真菌应对药物胁迫的转录调控却鲜有报道。将野生型和敲除株Δ03305分别接种于含有SDS和刚果红的PDA培养基进行培养。结果显示,与野生型相比,Δ03305的菌落大小无明显变化,说明基因F OXG₀3305不影响细胞壁完整性,Δ03305对AmB敏感性提高与细胞壁完整性无关。对野生型和Δ03305的麦角甾醇含量进行检测,Δ03305的麦角甾醇含量明显增加,说明基因FOXG₀3305参与调控麦角甾醇的生物合成。采用qPCR验证麦角甾醇生物合成相关基因mRNA表达水平的变化,与野生型相比,敲除株Δ03305中有4个基因（ERG7、ERG6、ERG3及ERG4）的mRNA表达水平明显提高,CYP51（甾醇14α-去甲基酶）和ERG9的mRNA表达水平明显降低,其他基因的表达水平无明显变化;采用qPCR检测尖孢镰刀菌基因组中14个与多药耐药相关的ABC转运蛋白mRNA表达水平的变化,与野生型相比,敲除株Δ03305中有2个基因（FOXG₁2868、FOXG₀5904）的表达水平明显降低,另外12个基因的表达水平无明显变化。经实验证明,基因FOXG₀3305缺失,不仅引起麦角甾醇合成相关基因表达的改变,还影响药物外排泵的表达。综上,基因FOXG₀3305缺失,引起麦角甾醇生物合成相关基因表达的改变、麦角甾醇含量增加以及药物外排泵的低表达,进而导致尖孢镰刀菌对AmB的敏感性提高。基因FOXG₀3305对尖孢镰刀菌AmB抗性的调节作用与麦角甾醇生物合成通路、药物外排泵相关。