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目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的常见内分泌代谢性疾病,随着人们生活方式的改变,其发病率日益增长,严重影响着人类的健康。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病主要的血管并发症之一,同时也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。Corin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,可以将心房钠尿肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)切割为具有活性的心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),进而发挥其调节水盐代谢平衡的作用。Corin是心脏特异性表达的蛋白酶,同时也表达在肾脏、小脑、皮肤及骨等组织。目前Corin的研究大多数围绕着高血压、心肌梗死、心衰等心血管疾病,也有少部分研究报道发现Corin与某些肾脏疾病如肾病综合征、肾小球肾炎等相关。本课题组前期研究发现,Corin与糖尿病主要血管并发症糖尿病心肌病和糖尿病肾病的发病密切相关,并且Corin的缺乏还会导致内皮功能障碍。但是,Corin缺乏引起内皮细胞功能损伤的分子机制尚不十分清楚。因此,本课题利用糖尿病肾病SD大鼠动物模型及si RNA干扰Corin基因处理HK-2肾小管上皮细胞株,采用细胞生物学及分子生物学技术,深入探讨Corin缺失引起内皮细胞障碍的机制,以期为研究糖尿病肾病诊断及治疗的新的分子靶点提供理论研究基础。方法1.利用本课题组成功构建的糖尿病肾病SD大鼠动物模型,采用免疫组织化学方法检测糖尿病肾病大鼠及正常对照组大鼠肾脏组织中Corin及ANP的表达情况;2.采用si RNA干扰技术处理HK-2肾小管上皮细胞,干扰Corin基因的表达,同时设置空白对照组和NC-si RNA组,培养48h后收集HK-2细胞上清,用收集的上清液培养EA.hy926内皮细胞株,24h后进行后续实验;3.通过细胞划痕实验观察空白对照组、NC-si RNA组及Corin-si RNA组EA.hy926内皮细胞增殖修复功能的变化;4.采用Western blot方法检测空白对照组、NC-si RNA组及Corin-si RNA组EA.hy926内皮细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)包括细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、p38蛋白激酶(p38)、c-jun-N末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)蛋白磷酸化表达水平的变化;5.采用Western blot方法检测空白对照组、NC-si RNA组及Corin-si RNA组EA.hy926内皮细胞内皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthase,e NOS)蛋白磷酸化表达水平的变化;6.在Corin干扰的HK-2细胞培养上清液中,加入外源性ANP蛋白,培养EA.hy926内皮细胞,通过内皮细胞划痕实验,观察空白对照组、NC-si RNA组、Corin-si RNA组及Corin-si RNA+ANP组EA.hy926内皮细胞增殖修复功能的变化;7.采用Western blot方法检测空白对照组、NC-si RNA组、Corin-si RNA组及Corin-si RNA+ANP组EA.hy926内皮细胞MAPK包括ERK、p38、JNK蛋白磷酸化表达水平的变化;8.采用Western blot方法检测空白对照组、NC-si RNA组、Corin-si RNA组及Corin-si RNA+ANP组EA.hy926内皮细胞内皮一氧化氮合酶(e NOS)蛋白磷酸化表达水平的变化。结果1.与正常对照组相比,糖尿病肾病SD大鼠肾脏组织Corin及ANP蛋白表达水平均降低。2.与空白对照组及NC-si RNA组相比,Corin-si RNA组内皮细胞增殖修复功能下降。3.与空白对照组及NC-si RNA组相比,Corin-si RNA干扰组EA.hy926内皮细胞的MAPK信号通路ERK、p38、JNK蛋白磷酸化水平明显升高,e NOS蛋白磷酸化水平显著下降。4.与Corin-si RNA组相比,给予外源性ANP蛋白后,EA.hy926内皮细胞增殖修复能力与正常水平一致。5.与Corin-si RNA组相比,给予外源性ANP蛋白后,EA.hy926内皮细胞MAPK信号通路ERK、p38、JNK蛋白磷酸化程度下降至正常水平,e NOS蛋白磷酸化程度上升至正常水平。结论综上所述,在本研究中我们发现糖尿病肾病Corin表达水平下降,表明Corin参与了糖尿病肾病的发生,同时Corin的缺乏会导致内皮细胞功能障碍,这一结果是通过上调MAPK信号、下调e NOS来完成的。给予外源性ANP后,内皮细胞功能得到改善,并且内皮细胞的MAPK信号通路ERK、p38、JNK以及e NOS蛋白磷酸化水平得到了恢复,以上结果表明,Corin是通过ANP来发挥作用的。因此我们得出以下结论,Corin介导的pro-ANP活化途径通过MAPK/e NOS信号通路在糖尿病肾病内皮功能障碍中发挥着重要的作用,Corin有望成为糖尿病肾病诊断及治疗新的分子靶点。