猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)属于圆环病毒科圆环病毒属成员,基因组为单链环状DNA。PCV2病毒基因组已经证明三个能够编码蛋白质ORF为：ORF1编码复制相关蛋白(Rep), ORF2编码衣壳蛋白(Cap),以及ORF3编码ORF3蛋白。PCV2对猪的致病性主要体现在免疫抑制。本研究对PCV2感染PK-15细胞的差异表达蛋白及与PK-15细胞蛋白间相互作用进行分析,旨在探讨PCV2在PK-15细胞的复制与感染机制。1、PCV2感染性克隆的构建在自然感染PCV2猪群中,猪体能够同时感染多种亚型的PCV2。对不同基因型的PCV2致病性进行研究,需要获得纯化的PCV2病毒。为了获得纯化的PCV2病毒,本研究通过克隆病毒全长基因组,并利用感染性克隆构建技术进行病毒遗传拯救以及拯救病毒的细胞培养特性测定,试验证明拯救的病毒与野生型病毒具有相似的复制能力。获得纯化的PCV2病毒为后续研究奠定基础。2、PCV2感染PK-15细胞后差异表达蛋白鉴定用遗传拯救的PCV2病毒粒子感染PK-15细胞,应用二维凝胶电泳结合质谱鉴定对感染的PK-15细胞进行蛋白质组学分析。二维凝胶电泳数据分析显示,在PCV2感染PK-15细胞后,共有61个差异表达蛋白被发现。差异表达蛋白主要出现在PCV2感染PK-15细胞后48-96 h。经过MALDI-TOF/TOF鉴定,共有44个差异表达蛋白点获得成功鉴定,包括22个上调表达蛋白点和22个下调表达蛋白点。22个上调表达蛋白点代表的18种蛋白是：蛋白酶体亚单位p40、NUP43蛋白、Ras相关蛋白Rap-2c、抑制素、3种肌动蛋白、微管蛋白、微丝相关蛋白、抗氧化蛋白4、抗氧化蛋白6、空泡离子泵亚单位B2、蛋白质磷酸激酶2亚型8、精氨酸脱亚氨酸酶、丙酮酸脱氢酶E1β亚基、异柠檬酸脱氢酶、酸性核蛋白体磷蛋白PO、酪氨酰tRNA合成酶。22个下调表达蛋白点代表的22种蛋白是：网素、中间丝相关蛋白、热休克蛋白27、延伸因子2、复制蛋白A2、嘌呤核苷磷酸化酶、鸟嘌呤单核苷酸合成酶、次黄嘌呤磷酸核苷转移酶、三联组氨酸、醛醇基转移酶、半乳糖变旋光酶,肽基异构酶、异柠檬酸脱氢酶、α烯醇化酶、6磷酸葡萄糖酸内脂酶、磷酸葡萄糖变位酶、3’磷酸腺苷5’磷酸硫酸合成酶、蛋白酶体β3亚基、蛋白酶体激活复合物亚基1、SKP1等位基因G2抑制剂、SH2/SH3衔接蛋白、同源异形盒前圆蛋白。上调蛋白与细胞骨架、生物合成、脂蛋白代谢、泛素蛋白酶体途径、信号转导和基因调控相关。下调蛋白与蛋白的转录和延伸、RNA的加工和合成、糖降解、氨基酸的转运和代谢、泛素蛋白酶体途径、信号转到、基因调控相关。利用real time RT-PCR方法,·在转录水平对质谱鉴定的20种差异表达蛋白进行了验证,结果表明差异表达蛋白转录本变化与二维凝胶电泳中的变化趋势呈部分一致。利用已有的单克隆抗体工具,借助Western Blot进一步验证了细胞的β-actin、a-tubulin以及cytokeratin 8,结果表明a-tubulin以及cytokeratin 8两种蛋白的变化趋势与二维电泳中两种蛋白点变化趋势一致。综上所述,PCV2感染PK-15细胞以后,引起细胞内骨架相关蛋白、应激反应蛋白、生物合成相关蛋白、泛素蛋白酶体相关蛋白、信号转到和基因调控相关蛋白的变化。3、PCV2衣壳蛋白与PK-15细胞蛋白a-tubulin相互作用的鉴定病毒编码蛋白在细胞内的分布决定病毒复制的部位,为了鉴定PCV2编码蛋白Rep和Cap在细胞内的亚胞定位,本试验通过构建Rep和Cap蛋白的重组真核表达载体转染PK-15细胞以及PCV2病毒粒子感染PK-15细胞进行研究,结果显示：Rep蛋白在感染后24 h、48 h定位在细胞核中,在72 h少量Rep蛋白出现在细胞浆中。PCV2 Cap蛋白在感染后的24 h定位在细胞核中,而48 h和72 h定位在细胞浆中。这表明PCV2在PK-15细胞复制过程中出现了Rep和Cap蛋白位移现象。细胞骨架对于细胞内的物质运输具有重要作用,基于蛋白组学发现的细胞骨架蛋白差异表达蛋白信息,为了分析PCV2编码蛋白在感染细胞内位移与细胞骨架的关系,应用双标记免疫荧光方法和免疫共沉淀试验对PK-15细胞骨架蛋白a-tubulin、β-actin、cytokeratin 8与PCV2编码蛋白的关系进行了鉴定。结果发现,仅Cap蛋白与a-tubulin之间存在共定位关系,Cap与a-tubulin能够形成复合物,证明PK-15细胞蛋白a-tubulin与PCV2 Cap蛋白存在着相互作用。