药用植物含有大量类型不同且结构特异的次级代谢产物,被广泛应用于预防和治疗各类疾病。萜类天然产物是现代药物的重要来源,有极大的研究价值。大部分植物体内萜类化合物的含量有限,严重限制了其应用。化学合成法虽然可以合成一些萜类化合物,但仍然难以合成结构复杂的萜类化合物,且具有能耗高、产量低、环境污染重等缺点。合成生物学为萜类化合物以及其他天然产物的合成提供了有效的手段。目前利用微生物细胞工厂合成一些重要的天然产物是合成生物学主流研究方向,其中一些细胞工厂的合成能力,已经达到了工业应用的水平。因受到复杂本底代谢背景的影响和限制,细胞工厂技术要求极其苛刻,一套成熟技术往往需要持续多年的积累。无细胞代谢工程作为生物工程的一种拓展手段,具有广阔的应用前景。将可再生的生物酶固定化是一种已经成熟应用的工业技术,且可实现酶制剂的反复利用,具有节约成本以及减少环境污染等特点。酵母表面展示技术是一种将外源分子以共价键展示于酵母表面的分子生物学工具,可以用来展示催化酶,形成生物固定化酶,避免复杂且严苛的酶表达与纯化过程,同时提高酶的催化活性和稳定性。本研究利用酿酒酵母表面展示技术,创新性地将甲羟戊酸（MVA）生物合成途径的8个酶、乙酰辅酶A合成酶及香叶醇合成酶表达于酵母表面,并得以构建可重复利用的体外多酶催化体系合成单萜香叶醇,为今后香叶醇及其他萜类化合物的生物合成提供了新思路与技术手段。主要结果如下:1.利用a-凝集素（a-agglutinin）酿酒酵母表面展示系统,将MVA合成途径中的酶,包括Atob、Erg13、mva A、Erg12、Erg8、Erg19、Idi1和Erg20,以及香叶醇合成酶t GES,以共价结合的方式固定到酿酒酵母EBY100的细胞表面,形成生物固定化酶。由单一生物固定化酶组成多酶催化体系,作为香叶醇合成模块,以1 mmol/L乙酰辅酶A为底物,成功合成了目标产物香叶醇,最高累积浓度为0.32±0.02 mg/L,证明本研究构建的生物固定化酶具有预期的催化功能。2.通过重新配比9种生物固定化酶的比例组成、定点突变修饰催化酶Erg20的催化活性、偶联NADPH和ATP再生模块、焦磷酸清除模块和生物固定化酶产生的“底物通道效应”,成功将香叶醇合成模块的效率提高了6.8倍,产量为2.17±0.09 mg/L。上述实验结果说明,本研究构建的体外多酶催化体系具有较大的优化空间,且优化过程应从全局出发,进行整体优化。3.利用乙酰辅酶A合成酶Acs2,以2 mmol/L乙酸钠为底物,利用多酶催化体系成功合成了香叶醇;24 h后香叶醇的累积浓度最高值达到1.31±0.08 mg/L;通过模块固定化处理,实现了体外香叶醇合成系统的重复利用,7次重复利用后,香叶醇的最高累计浓度达到了7.55±0.43 mg/L。上述实验结论说明本研究构建的生物固定化酶可被重复利用并能较高水平的保持酶的生物活性,有利于降低体外多酶催化的酶制备成本。