研究背景：　　炎性疾病是一种在全世界范围内广泛流行的世界性疾病。炎症反应是人类机体对有害的外来刺激做出的一种应答，伴随着典型的特征，如红肿热痛。炎症的发生是一个复杂的病理学过程，由微生物病原体触发引起，例如病毒，细菌，真菌等。用于治疗急性和慢性炎症性疾病的药物抑制了对其产生作用的生物过程炎症的开始和症状。很多疾病的发生跟炎症密切相关，包括冠状动脉粥样硬化症，肥胖症，哮喘，关节炎，代谢性综合征。　　糖皮质激素(GCs)是最重要也是最常用的抗炎药物。糖皮质激素作为急性和慢性炎症性疾病的最有效的治疗药物，在市场上的运用已经超过了60年。它的适应症包括过敏性和非过敏性疾病，如哮喘，慢性阻塞性肺病，风湿性关节炎等其它疾病。目前，糖皮质激素对于炎性疾病的治疗是非常有效的，但是长期使用也会产生一些严重的副作用如皮肤细化，降低骨密度，糖皮质激素抵抗以及葡萄糖耐受不良等不良反应。因此，寻找一种高效而副作用低的糖皮质激素类药物成为了科学家们近年来的研究热点。　　含氮杂环的甾体化合物是一类具有较低的毒性作用同时又具有广泛生物活性的物质，包括抗肿瘤活性、抗炎活性、抗菌活性、抗高血压和抗寄生虫等。含氮杂环甾体作为一个药物活性载体和药物的基本骨架结构，在多种药理的作用下，科学家们不断对其进行深入研究，并设计改造、修饰其化学结构，进一步找到符合用药要求的新的化学结构，从而开发出新的药物。例如具有含氮杂环甾体化合物阿比特龙（Abiraterone）目前应用于临床晚期前列腺癌的治疗，VN/124-1（Galeterone）也已成功完成了前列腺癌治疗的二期临床发展，VN/85-1通过抑制CYP17降低循环雄激素水平。本实验从孕烯醇酮为原料合成了12个含氮杂环的甾体化合物以及 8 个酯类甾体化合物, 并用脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞所建立起的炎症模型作为研究的对象，筛选出对RAW264.7巨噬细胞毒性小，而抗炎活性相对较强的目标化合物；再通过目标化合物药物对NO分泌量和炎症相关介质TNF-α，PGE-2，IL-6的表达量的影响的实验结果进行分析，为药物的研究开发提供了理论和科学依据。　　研究目的：　　设计、合成含有不同性质取代基的含氮杂环的甾体衍生物以及酯类甾体衍生物，以脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞所建立起的炎症模型作为研究的对象，先通过细胞毒性实验以及NO实验发现母核结构上不同取代基对其抗炎活性的影响，筛选出效果最优、而毒性较低的目标化合物;然后再观察目标化合物对脂多糖（ LPS ）诱导的小鼠RAW264.7 细胞炎症介质 TNF-α、PGE-2，IL-6，iNOS 表达的动态变化，探讨目标化合物炎症反应的机制，并为后续的化合物设计和研究提供理论参考依据。　　研究方法：　　(一) 合成部分　　以孕烯醇酮和含不同取代基的苯甲醛为原料，通过 Claissen-Schmidt 缩合反应合成不同的具有以甾体为母核结构的查尔酮类衍生物；　　1)甾体查尔酮类衍生物和氨基硫脲反应，在碱性条件下加热回流进行环合反应，得到具有不同取代基的吡唑啉结构的甾体衍生物。　　2)将第一步得到的甾体查尔酮衍生物和肉桂酸反应，在二氯甲烷中通过EDCI/DMAP酯化反应合成C17位具有不同取代基的酯类甾体衍生物。　　(二) 药理部分　　采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞建立炎症反应模型。　　1)分别采用MTT（噻唑蓝）法和NO实验法测定各化合物（初筛浓度为3 μmol/L）对LPS诱导的RAW264.7细胞活力的影响及对NO释放量的抑制情况，并筛选出细胞毒性低并且具有较强抑制NO释放能力的目标化合物。　　2)噻唑蓝比色实验（MTT法）　　①MTT（噻唑蓝）法检测目标化合物对小鼠RAW264.7巨噬细胞活力的影响。药物作用RAW264.7巨噬细胞24小时，实验分为两组：空白对照组、单纯药物组：目标化合物浓度为0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L。　　②MTT（噻唑蓝）法检测目标化合物对 LPS 诱导的小鼠 RAW264.7 细胞活力的影响。药物作用细胞24小时，实验分为三组：空白对照组、LPS模型损伤组（1μg/ml）、LPS+目标化合物组（0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L）。　　3)采用硝酸还原酶法测定细胞一氧化氮（nitric oxide，NO）实验，检测不同浓度目标化合物对 LPS 诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞释放 NO 的影响,检测药物对NO释放量的抑制情况。药物作用细胞24小时，实验分组：空白对照组，LPS模型损伤组（1μg/ml），药物干预组：LPS+目标化合物 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L。　　4) 采用酶联免疫法（ ELISA ）检测不同浓度目标化合物对 LPS 诱导的巨噬细胞RAW264.7 分泌细胞因子TNF-α、IL-6、PGE-2 水平的影响;药物作用细胞24小时，实验分组：空白对照组，LPS模型损伤组（1μg/ml），药物干预组：LPS+目标化合物 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L。　　5) Western blot 技术检测 RAW264.7 巨噬细胞 COX-2及 iNOS 蛋白的表达；　　研究结果：　　(一) 合成部分　　合成了12个新型含氮杂环甾体类化合物和8个新型酯类甾体化合物，结构经MS, 1H-NMR, IR等方法确证。　　(二) 药理部分　　1) 通过MTT法和NO实验法初步筛选各化合物在3μmol/L时对RAW264.7细胞作用24h后细胞的活力、NO水平的影响，在一系列的氮杂环甾体衍生物中，4a, 4e, 4g, 4h, 4i对NO 的产生的抑制率分别为 82.27±4.80%，88.10±0.37%，94.72±0.96%，93.80±0.78%， 75.26±4.80%;在一系列的酯类甾体衍生物中，4A，4C，4H对NO的产生的抑制率分别为79.0±1.34%，79.06±0.75%，90.93±0.85%。筛选出化合物4g及4H作为目标化合物继续进一步研究。　　2) ①与空白对照组比，化合物4g，4H在 0.1μM至3.0μM组的细胞活力无明显影响（P＞0.05）。　　②与空白对照组比，LPS（1μg/ml）作用RAW264.7巨噬细胞24小时后，细胞活力降低到40.86±1.49(P<0.01)。LPS（1μg/ml）和浓度为0.1-30 μM 的化合物4g共同处理细胞24小时后，化合物4g在0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM组的细胞活力分别为99.79±0.18%, 100.05±0.36%, 98.13±1.95%, 99.58±0.63%, 83.54±0.37%，48.58±1.26%; LPS（1μg/ml）和浓度为0.1-30 μM的化合物 4H共同处理细胞24小时后，化合物4H在0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L 组的细胞活力分别为 92.11±0.50%, 96.6±0.98%, 89.72±2.14%, 92.0±1.41%, 88.45±0.30%，82.77±1.70%;与 LPS 模型组比，均有所降低（P<0.01）。4g 在 0.1, 0.3, 1, 3μmol/L时对RAW264.7细胞无毒性，10, 30 μM时对RAW264.7细胞具有毒性；4H在0.1, 0.3, 1, 3μmol/L时对RAW264.7细胞无毒性，10, 30μmol/L时对RAW264.7细胞具有微弱的毒性。　　3) LPS（1μg/ml）作用RAW264.7巨噬细胞 24 小时后, 培养基中 NO 含量从 3.70±3.13上升至 108.64±1.91( P<0.01)；LPS （ 1μg/ml ）和 化合物 4g 0.1-30μmol/L 共同处理RAW264.7巨噬细胞24 小时,化合物4g 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L组的 NO 含量分别为97.85±4.41，83.87±2.89，59.14±4.41，43.01±1.67，34.41±3.33，29.03±2.89，与 LPS 模型组（108.64±1.91）比，药物组 4g 0.3, 1 , 3, 10, 30μmol/L 的 NO 的量均减少(P<0.01)；化合物4g 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L对 NO 的抑制率分别达到 29.39±1.27%，56.57±6.42%, 74.14±3.46%, 83.54±4.83%, 89.49±6.12%。　　4） LPS（1μg/ml）和 化合物4H 0.1-30μmol/L 共同处理细胞 24 小时, 化合物4H 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L组的 NO 含量分别为 95.70±1.67，83.87±2.89，66.67±3.33，51.61±2.89， 45.16±2.89，41.94±2.89，与 LPS 模型组（108.64±1.91）比，药物组 4H 0.3, 1 , 3, 10, 30μmol/L 的 NO 的量均减少(P<0.01)；化合物4H 0.3, 1, 3, 10, 30 μM对 NO 的抑制率分别达到 29.43±2.14%，48.23±1.6%, 64.70±0.64%, 71.76±0.51%, 75.37±5.90%。与空白对照组比较,阳性对照LPS能极显著提高RAW264.7细胞释放NO的能力(P<0.01)。化合物4g， 4H 与 LPS 刺激的 RAW264.7 巨噬细胞共同作用 24 h 后，化合物 4g, 4H 于浓度0.3-30μmol/L 范围内对巨噬细胞释放的 NO 含量具有明显的抑制作用（P<0.01），且呈剂量依赖性。　　5）与对照组相比，LPS 刺激巨噬细胞后，释放的 TNF-α、IL-6、PGE-2 含量明显增高（P<0.01），0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30μmol/L浓度的 4g, 4H与 LPS 刺激的巨噬细胞共同孵育后，对巨噬细胞释放的 TNF-α、IL-6、PGE-2 具有明显的抑制作用（P<0.01），且呈剂量依赖性。　　6）与对照组比较，LPS组COX-2、iNOS蛋白表达均显著增高（P<0.01或者P<0.05）；0.1, 1, 10μmol/L浓度的 4g与 LPS 刺激的巨噬细胞共同孵育后，COX-2、iNOS蛋白表达水平均明显降低，呈浓度依赖性。　　结论：　　1）化合物 4g, 4H 在低浓度时对 RAW264.7 细胞活力无明显影响，在高浓度时对RAW264.7 细胞具有一定毒性。　　2）化合物4g，4H对 LPS 诱导的 RAW264.7巨噬细胞的 NO 生成有明显的抑制作用，表明化合物4g，4H能够直接抑制LPS诱导的NO的产生。　　3）化合物 4g 或者 4H 一定程度上有效的减少巨噬细胞的炎性损伤，表现为炎症因子PGE-2、IL-6 和 TNF-α 含量与 LPS 损伤组相比明显降低，说明化合物 4g，4H 能够通过减少这些炎症因子的释放来抑制 LPS 诱导的炎症损伤。　　4）化合物 4g 通过抑制 COX-2 和 iNOS 的活性来发挥其抗炎的作用，并且通过影响COX-2和iNOS的活性而调控 PGE-2和 NO的表达。