细胞中胆固醇和组织转谷氨酰胺酶的原位成像检测

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细胞是生物体结构和功能的基本单位。胆固醇除了在细胞质膜中大量存在,在细胞内也会以胆固醇酯的形式进行储存,用于维持细胞中胆固醇含量的动态平衡。然而一旦这种动态平衡被打破,则会影响人体的正常代谢及各种生理活动的进行,进而导致动脉粥样硬化、脂肪肝等各种疾病。除了胆固醇这类脂质分子,细胞的代谢活动还离不开各种酶的参与,其中转谷氨酰胺酶作为组织、细胞内大量存在的一种具有变构效应及蛋白交联作用的酶,其构象与活性受到Ca2+和GTP的影响。它不仅参与细胞分化、细胞凋亡、信号转导等多种生理活动,在细胞中的活性表达程度还与心血管疾病、腹腔疾病和脂泻病等疾病密切相关。因此,设计并构建高效、灵敏的策略分别实现对细胞中胆固醇及转谷氨酰胺酶的检测对于人类多种疾病的早期诊断治疗都具有十分重要的意义。本论文围绕细胞中胆固醇和转谷氨酰胺酶的高通量检测,开展了如下研究:(1)设计并构建了一种基于级联反应的微孔阵列芯片,用于细胞膜及细胞内胆固醇的高通量检测。该微孔阵列芯片通过将鲁米诺修饰的金纳米粒子(Au@luminol)、大豆过氧化物酶(SBP)和胆固醇氧化酶(ChoX)固定在醋酸纤维素(CA)薄膜修饰的微孔阵列中得到,胆固醇被包埋于微孔中的ChoX催化氧化产生H2O2,生成的H2O2与固定在金纳米粒子表面的鲁米诺发生氧化还原反应而产生化学发光信号,实现了对胆固醇的检测。其检测的浓度范围为0.12μM-1000μM,检出限为0.08μM。该方法具有较高的选择性、灵敏度、精确度以及良好的稳定性,成功运用于血清样品及细胞膜和细胞内胆固醇的原位成像检测。此外我们还探究了载脂蛋白(ApoA-Ⅰ)、匹伐他汀(Pitavastatin)和普罗布考(Probucol)这三种药物对细胞膜及细胞内胆固醇含量的影响,为胆固醇相关疾病的诊断治疗提供了新的思路。(2)基于聚集诱导发光(AIE)原理,发展了细胞内转谷氨酰胺酶(TG2)活性检测的荧光探针。该探针由聚集诱导发光分子四苯乙烯(TPE)与TG2特异性识别的肽链通过点击化学(Click)反应得到,TPE分子的水溶性及光学性质在与肽链交联后发生显著变化。在Ca2+存在的条件下,TG2呈现出具有活性的伸展构象,将探针中两种肽链的赖氨酸(K)和谷氨酰胺(Q)进行特异性偶联,使得TPE分子发生聚集并伴随分子内/间旋转受限,在315 nm的激发光照射下产生荧光发射现象,实现了对TG2的灵敏检测。其检测的浓度范围为0.1 nM-2.5 nM,检出限为0.02 nM。该探针具有良好的稳定性和选择性,成功应用于对细胞中活性TG2的靶向荧光成像检测,并研究了半胱胺对细胞内TG2活性的抑制作用,探讨了该探针用于对细胞中TG2活性检测的有效性及可靠性。
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