论文部分内容阅读
作为一种新型纳米材料,碳纳米管（CNTs）由于具有独特的结构和物理化学性质而受到广泛的关注。一方面,CNTs在生物医药领域有潜在的应用,研究表明CNTs在生物传感器、分子运输载体、辅助肿瘤成像等方面具有巨大的应用潜力。另一方面,由于CNTs质量轻,容易在空气中传播,很容易通过呼吸道进入体内从而对肺部或其他脏器产生毒性。因此关于CNTs及其衍生物安全性及毒性的研究引起了人们广泛的关注。本课题的目的和意义:目前采用静脉注射的的方式研究CNTs体内毒性的报道较少。基于此,我们首先开展了静脉注射羧基化多壁碳纳米管在小鼠体内急性毒性的研究。本文通过组织病理学评价以及血清生化指标的分析,较系统的研究了羧基化多壁碳纳米管在小鼠体内的急性毒性,并比较了不同团聚程度的羧基化多壁碳纳米管在小鼠体内行为的不同。为进一步探讨CNTs的体内行为、毒性及作用机制提供依据。方法:1.羧基化多壁碳纳米管的制备多壁碳纳米管（MWNT）（直径10nm或40nm）置于1:3混合的HNO3/H2SO4溶液中,60℃下超声3h。倒入大量去离子水中,得到良好分散的黑色溶液。将此溶液用0.22μm聚碳酸酯微孔滤膜过滤,用去离子水充分洗涤至滤液pH值为7.0。将滤膜上的碳管真空干燥24h获得羧基化的多壁碳纳米管（MWNT-COOH）粉末,产物用傅立叶变换红外光谱（FTIR）检测分析。2.MWNT-COOH分散性比较将10nm-MWNT-COOH加入PBS中超声10min得到悬浊液A;将40nm-MWNT-COOH加入PBS中超声10min得到悬浊液B;将10nm-MWNT-COOH加入含有1%的PBS中超声10min得到悬浊液C;将40nm-MWNT-COOH加入含有1%的PBS中超声10min得到悬浊液D。悬浊液A、B、C和D的终浓度为0.5mg/ml。通过比较几种悬浊液的沉淀时间比较几种悬浊液中MWNT-COOH的分散程度。3.BCA方法测定MWNTs对小鼠血清蛋白的吸附将直径为10nm的羧基化多壁碳纳米管（10nm-MWNT-COOH）和直径为40nm的羧基化壁碳纳米管（10nm-MWNT-COOH）分别分散于PBS缓冲液中,终浓度均为200ug/ml,超声10min使MWNT-COOH达到均匀分散。将20ul稀释的小鼠血清加至200ul碳纳米管溶液中,混匀,室温孵育2h,13000g室温离心10min,取上清液。通过BCA法测定上清中蛋白含量。总蛋白与上清蛋白含量的差值即为MWNT-COOH所吸附的蛋白量。4.急性毒性实验120只健康BALB/C小鼠（体重18-20g,购自山东大学动物中心）经适应性饲养7天后,将其随机分为A、B、C、D四组（n=30）,采用以下方式分别经尾静脉一次性注射以下试剂（浓度为10ml/kg）,A组:在磷酸盐缓冲液（PBS）中超声10min均匀分散的10nm-MWNT-COOH,终浓度为0.5mg/mL;B组:在含有1%tween80的PBS中超声10min均匀分散40nm-MWNT-COOH,终浓度为0.5mg/ml;C组:PBS对照组;D组:含有1%Tween 80的PBS对照组。常规颗粒饲料喂养,自由饮水,温度20±2℃,湿度（40-60）%。注射后对小鼠毛发、食欲、行为状态及动物死亡情况进行观察,每周称体重1次。每组均设置三个时间观察点,分别是第1天、7天和28天。于第1天和7天分别从每组随机抽取10只小鼠,解剖后迅速摘取心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,脑。肉眼观察各脏器颜色和外观后用10%福尔马林将其固定24h,用于制备病理切片。每组剩余的10只小鼠于第28天摘眼球取血（取血前禁食12h）,将小鼠全血3000g离心10min去除血细胞。小心吸取上层血清-20℃冷冻保存待测。将小鼠解剖,迅速摘取心脏,肝脏,脾脏,肺脏,肾脏,脑。肉眼观察各脏器颜色和外观后用10%福尔马林将固定24h,用于制备病理切片。5.血清生化指标的测定测定冷冻保存的小鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的含量。测定在全自动生化分析仪上进行。6.组织病理学切片（HE染色）的制备（具体步骤略）结果:1.碳纳米管对血清蛋白吸附的测定在同样条件下,每毫克10nm-MWNT-COOH吸附的小鼠血清蛋白量为0.75mg,40nm-MWNT-COOH吸附的小鼠血清蛋白量为0.20mg。经计算知10nm-MWNT-COOH吸附的血清蛋白为总量的39.85%,40nm-MWNT-COOH吸附的血清蛋白为总量的10.75%。2.MWNT-COOH分散性的比较我们通过观察发现,悬浊液A中的10nm-MWNT-COOH的分散性最差,团聚程度最高。通过对悬浊液B的观察,发现通过1%Tween 80助溶也不能较大改善10nm-MWNT-COOH的分散性。而悬浊液C中40nm-MWNT-COOH的分散性较好。1%Tween 80的加入更能够较大改善40nm-MWNT-COOH的分散性。所以为了比较不同分散性MWNT-COOH对小鼠的记性毒性,我们选取了悬浊液A和悬浊液D作为小鼠急性毒性的实验材料。3.动物行为的观察与体重变化经观察受试组与对照组小鼠毛发光泽,体态活泼,反应敏捷,食量、排泄物均正常。4.血液生化指标的测定结果受试组小鼠与对照组小鼠血清中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肌酐（CR）和尿素氮（BUN）含量没有显著差异（P＞0.05）5.动物体重的变化对照组与受试组小鼠在四周内体重变化的差异不显著（P＞0.05）。6.病理切片的结果肺部:A组:在暴露1d后,肺部切片中可见大量的黑色颗粒物,系10nm-MWNT-COOH积累于肺部毛细血管的团聚物。随着暴露时间的延长,10nm-MWNT-COOH在肺部的积累逐渐减少,但在暴露28d时在肺部仍然可查见大量的10nm-MWNT-COOH。相比之下,在1d、7d、28d,B组、C和D组小鼠的肺部均未见黑色颗粒物存在,说明B组小鼠的肺部没有40nm-MWNT-COOH的积累。各受试组与对照组碳纳米管在28d内未引起小鼠肺部的组织病理学改变。气管、各级支气管及肺泡、肺泡间隔形态结构正常,未见充血、增生等形态学改变,肺泡内也未见肺泡巨噬细胞增多。肝脏:A组:暴露1d后小鼠的肝脏未见棕黑色点状物的存在,但在暴露7d以及28时,肝脏组织中发现黑色颗粒物的积累,说明10nm-MWNT-COOH在肝脏中的积累是逐渐增多的。B组小鼠暴露1d时肝脏中可见大量的40nm-MWNT-COOH团聚物,团聚物的数量随暴露时间的延长逐渐减少,在28d后肝脏中未发现40nm-MWNT-COOH的团聚物。所有暴露组与对照组肝小叶、肝窦、肝板及肝细胞结构正常,未见肝细胞变性坏死等形态学改变。心脏:与对照组相比较,受试组小鼠（A组和B组）在暴露1d与7d后小鼠的心肌间质中查见散在的炎细胞浸润。在暴露28d时,心肌间质也恢复正常,未见充血及炎症等病理形态学改变。心内膜、外膜、心肌及心肌间质组织结构正常,心肌纤维未见明显变性、坏死等形态学改变。脾脏:受试组（A组和B组）小鼠在注射1d和7d后小鼠脾脏的部分脾索中查见巨核细胞及多核巨细胞显著增多。但未见组织病理学的改变。在暴露28d后脾脏中巨核细胞及多核巨细胞数量恢复正常。脑:所有受试组与对照组大脑皮层、小脑等结构正常。血管轻度充血,未见水肿及脑软化灶等改变。肾脏:所有受试组皮髓质结构正常,肾小体未见明显充血及渗出等改变。结论:1.体外实验表明,与40nm-MWNT-COOH相比较,团聚程度较大的10nm-MWNT-COOH容易结合较多的小鼠血清蛋白。2.MWNT-COOH的团聚程度影响其在体内的行为,分散于PBS中的10nm-MWNT-COOH的团聚程度要高于分散于含有1%Tween80PBS中的40nm-MWNT-COOH。10nm-MWNT-COOH彼此相互吸附会形成较大的团聚物,因此在通过尾静脉注射进入小鼠血液后,大量的团聚物会堵塞于小鼠肺部的毛细血管中。随着暴露时间的延长,积累在肺部的10nm-MWNT-COOH团聚物有少量的清除,但在暴露28d后,肺部仍有大量的10nm-MWNT-COOH团聚物积累。而肝脏中10nm-MWNT-COOH团聚物积累逐渐增加与肺部10nm-MWNT-COOH积累逐渐减少的趋势说明从肺部清除的部分10nm-MWNT-COOH随血液循环经过肝脏时会被肝脏所吸收。肝脏中积累的10nm-MWNT-COOH团聚物在28d后仍未清除。对于40nm-MWNT-COOH来说,由于其在1%Tween80的PBS中分散性较好,没有形成大体积的团聚物,因此其在肺部没有积累。但暴露1d后,在肝脏中可见较多的40nm-MWNT-COOH团聚物,肝脏中40nm-MWNT-COOH的积累具有随时间逐渐减少的趋势。在暴露28d后,小鼠肝脏中的40nm-MWNT-COOH团聚物基本被清除。脾脏中巨噬细胞增多说明脾脏也参与了对两种MWNT-COOH的吞噬,但从脾脏的病理切片中未能发现MWNT-COOH团聚物的存在。3.我们的实验结果表明经静脉注射的MWNT-COOH在小鼠体内会被富于单核巨噬细胞的肺脏、肝脏和脾脏等脏器吸收。4.通过组织病理学检查,在5mg/kg的暴露剂量下,在28d内,两种MWNT-COOH没有对小鼠产生急性毒性。小鼠的各主要脏器（肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏和脑）没有明显的病理学改变。血清生化指标也表明小鼠的肝脏和肾脏的功能未受影响。