论文部分内容阅读
【目的】1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)属于鞘磷脂类,在很多细胞中都有表达,而血浆中游离的S1P主要是与高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)相结合,从而介导HDL的诸多功能,S1P主要通过结合它在细胞膜表面的5个膜受体S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4、S1PR5来实现这个作用。已知HDL的天然高亲和生理性受体之一就是清道夫受体B类I型(Scavenger receptor class B type I,SR-BI),与S1P不同,SR-B1通过结合载脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-I,apoA-I)来介导HDL的一些生物学功能。研究显示,S1P/S1PR1可以介导人脐静脉内皮细胞的迁移,这一机制可以通过MEK1/2-ERK1/2信号通路来实现,同时研究显示HDL可以通过SR-BI介导多种生物学功能,这些功能的分子机制同样涉及MEK1/2-ERK1/2信号通路。但有关HDL/SR-BI介导人脐静脉内皮细胞迁移的分子机制少见报道,那么它们是否能够通过MEK1/2-ERK1/2信号通路来调节人脐静脉内皮细胞的迁移、它们之间是否互相影响以及怎样影响都还不清楚。因此,这些就是本文的研究内容,希望本文的研究结果,有助于为进一步加深了解HDL的内皮保护功能。【方法】1.体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),选择不同浓度S1P进行处理,采用细胞划痕试验和Transwell检测内皮细胞迁移,然后筛选出S1P适宜的浓度。处理人脐静脉内皮细胞不同时间,在不同时间点用细胞划痕试验和Transwell检测内皮细胞的迁移情况,筛选出适宜的处理时间。2.根据上一步骤的实验结果选择合适的S1P浓度和相应的处理时间进行处理,然后加入SEW2871(S1P1特异性激动剂)和W146(S1P1抑制剂),细胞划痕试验和Transwell检测细胞迁移,Western Blot检测磷酸化MEK1/2、磷酸化ERK1/2的水平。3.用PD98059(MEK的特异性抑制剂)处理,Western Blot检测内皮细胞中磷酸化MEK1/2和磷酸化ERK1/2水平变化,细胞划痕试验和Transwell检测人脐静脉内皮细胞迁移。4.用U0126(ERK1/2抑制剂)处理人脐静脉内皮细胞,Western blot检测磷酸化的MEK1/2和磷酸化ERK1/2水平的变化,用细胞划痕试验和Transwell检测人脐静脉内皮细胞迁移。5.通过转染过表达SR-BI或用BLT-1处理(SR-BI抑制剂),再Western Blot检测磷酸化MEK1/2和磷酸化ERK1/2的水平,细胞划痕试验和Transwell检测人脐静脉内皮细胞迁移。【结果】1.S1P在1μmol,24h处对内皮细胞迁移的促进作用最强。2.SEW2871激活S1P1后,p-MEK、p-ERK总量相比增加,细胞迁移增强。用W146处理得到相反的实验结果。3.MEK特异性抑制剂处理后,与对照组相比,p-MEK和p-ERK水平都降低,相应的,S1P对人脐静脉内皮细胞迁移的促进作用减弱。4.ERK抑制剂处理后,得到与抑制MEK处理结果变化趋势类似的实验结果。5.转染过表达SR-BI后,磷酸化的ERK和AKT水平都升高,S1P对人脐静脉内皮细胞迁移的促进作用也相应增强;抑制剂处理SR-BI后,得到与过表达SR-BI相反的试验结果。【结论】SR-BI与S1PR1通过MEK1/2-ERK1/2信号通路共同调节HUVECs的迁移。