慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)是一种可以预防和治疗的慢性气道炎症性疾病,疾病发展过程伴有不完全可逆的气流受限,其病理学基础是气道对不同有害颗粒和气体刺激引发的异常炎症反应。COPD的发病机制目前仍不明确,可能跟气道炎症,氧化应激,蛋白酶／抗蛋白酶失衡,微生物病原体,自身免疫,细胞凋亡等有关。吸烟是COPD最主要的诱发因素之一,临床研究结果显示吸烟产生的活性氧分子(reactive oxygen species, ROS)作用于肺泡巨噬细胞和表皮细胞,从而导致炎症因子的大量表达和生长因子的释放。动物实验证实ROS还能诱导和促进表皮细胞的凋亡。mTOR (Mechanistic Target of Rapamycin, mTOR)是一种非典型的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,属于磷酸肌醇3激酶(PI3K)相关的激酶家族。机体和细胞利用mTOR信号通路感受并整合各种外界因素如生长因子、应激水平、能量水平、氧气浓度以及氨基酸水平等的影响,通过调控其下游各种信号途径调节机体内基因转录、蛋白质翻译起始、脂质体合成、能量代谢以及细胞自噬等生理过程,从而调节细胞的生长和代谢,并保持机体和细胞的稳态平衡。其中最重要的一项功能是调控细胞自噬。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究发现细胞自噬可能通过介导吸烟诱导的气道上皮细胞凋亡从而导致COPD的形成；细胞自噬相关基因LC3B的缺失抑制了吸烟诱导的COPD;而Egr-1和Cav-1等分子则可能通过其对细胞自噬和细胞凋亡的调控而影响吸烟诱导的COPD的形成。据此,我们提出本论文的关键科学问题：细胞自噬的上游信号mTOR是否也在吸烟诱导的气道上皮细胞损伤和COPD形成过程中起到关键调控作用?如果可以,mTOR又是通过什么样的分子机制调控这一过程?针对上述假设,体外研究拟利用香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)处理人体气道上皮细胞系以及检测慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸烟者的肺组织标本。体内研究拟构建气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞mTOR特异性诱导敲除小鼠并给予香烟烟雾暴露,通过测定mTOR相关信号通路分子的表达、细胞自噬与凋亡、炎症因子表达、气道炎症细胞浸润、粘液分泌以及小鼠肺平均内衬间隔(MLI)等因素,阐明mTOR信号通路在吸烟诱导的气道炎症和COPD分子发病机制中的关键调控作用,为有效预防和治疗吸烟诱导的气道炎症提供新思路,为开发新型COPD防治药物提供新靶点。第一部分：AMPK/TSC2/mTOI信号通路在CSE诱导的人体气道上皮细胞系炎症和凋亡以及COPD患者肺组织中的调控作用及其机制研究目的：证实CSE能诱导人体气道上皮细胞系mTOR信号通路相关分子的磷酸化水平或者表达水平的改变；并通过应用饥饿或siRNA干扰技术,证明nTO R能调控CSE诱导的人体气道上皮细胞炎症因子释放、自噬、坏死与凋亡。方法：以3%低浓度CSE干预人体气道上皮细胞系HBE,做不同的浓度和时间点处理,0、1、4、8、和24h后收集细胞。、Western Blot和Q-PCR法检测mTOR相关信号分子(AMPKa、TSC1、TSC2、mTOR、S6和LC3B)的磷酸化水平或者表达水平。Elisa和Q-PCR法检测炎症因子IL-6、IL-8的mRNA和蛋白质水平。然后,以较高浓度10%的CSE,干预人体气道上皮细胞系HBE,做不同的浓度和时间点处理,0、1、4、8和12h后收集细胞。Western Blot法检测细胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。最后,利用HBSS溶液饥饿诱导、TSC2siRNA和mTOR siRNA基因沉默以及给予药物抑制剂等方法,研究AMPKa/TSC2/mTOR信号通路在CSE诱导人体气道上皮细胞中炎症因子分泌、自噬与凋亡的水平。另外,Western Blot和免疫组化方法检测慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸烟者肺组织mTOR和坏死蛋白RIP3的表达情况。结果：与正常对照组相比,CSE组在人体气道上皮细胞系HBE中诱导AMPK的磷酸化和TSCl/2的高表达,下调mTOR和p-S6的表达水平,诱导细胞自噬蛋白LC3B-II表达增加。同时,炎症因子IL-6和IL-8表达水平以及粘蛋白Muc5ac表达也明显增加。凋亡蛋白cleaved caspase-3和cleaved-caspase-9表达增加。沉默TSC2基因或应用自噬抑制剂氯喹和巴佛洛霉素A1下调CSE诱导的炎症和凋亡。相反,应用HBSS溶液饥饿诱导或沉默mTOR基因CSE诱导的炎症和凋亡增加。通过对慢性阻塞性肺疾病患者和正常非吸烟者肺组织检测,发现mTOR和p-S6蛋白表达水平有一定程度下降,相反,坏死蛋白RIP3表达水平增加。结论：AMPKa-TSC2-mTOR信号通路调控CSE诱导人体气道上皮细胞中炎症因子分泌,自噬、坏死与凋亡。沉默TSC2基因或应用自噬抑制剂氯喹和可以保护CSE诱导的炎症和凋亡。相反,饥饿或沉默mTOR基因恶化CSE诱导的炎症和凋亡。第二部分：mTOR信号通路在香烟烟雾暴露诱导的小鼠慢性气道炎症和肺气肿模型中的研究目的：利用C57BL/6、气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞mTOR特异性诱导敲除的小鼠,从体内证实mTOR信号通路在吸烟诱导的气道炎症和肺气肿形成中的关键调控作用。方法：野生型的C57BL/6小鼠给予香烟烟雾分别暴露0、12周、24周,Western Blot、Q-PCR和免疫组化检测mTOR相关信号分子的磷酸化水平或者表达水平、炎症表达水平和肺气肿情况。利用mTORflox/flox小鼠,分别和气道上皮细胞(CC10-rtTA/(tetO)7-Cre-)、肺泡Ⅱ型上皮细胞(SP-C-rtTA/(tetO)7-Cre-)的工具小鼠合笼,构建气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞mTOR特异性诱导敲除的小鼠品系,并给与口服强力霉素诱导mTOR基因敲除。上述两种mTOR诱导敲除的小鼠以及其同窝对照组小鼠随机分成吸烟组和空气对照组,香烟烟雾暴露(0、4周、8周、12周、24周),构建慢性气道炎症和肺气肿模型。Q-PCR和ELISA法检测气道炎症因子IL-6和IL-8的分泌。Western blot和免疫组化方法检测凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9、坏死蛋白RIP3以及mTOR相关信号分子(TSC2、mTOR、S6和LC3B)的磷酸化水平或者表达水平。结果：香烟烟雾暴露24周后,野生型小鼠肺组织mTO R和p-S6水平显著下降,而TSC2蛋白表达水平增高。另外,与香烟烟雾暴露10周后的mTOR未诱导敲除小鼠相比,Western Blot和免疫组化结果显示气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞mTOR特异性诱导敲除小鼠肺组织中,mTO R蛋白水平下降明显。H&E染色结果显示肺组织一定程度上出现异常,小鼠肺平均内衬间隔(MLI)增宽,气道周围和肺泡上皮炎症细胞浸润较明显,小鼠肺组织内粘液分泌增多。结论：mTOR在小鼠气道上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞的诱导性敲除将恶化吸烟诱导的炎症、自噬、坏死与凋亡,进而导致气道炎症和肺气肿的形成。