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目的Toll样受体3(Toll like receptor 3,TLR3)在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)细胞中表达于细胞膜和/或细胞质,但主要表达于细胞质。课题组前期构建的双链RNA(ds RNA)(BM-06)处理或转染HCC细胞后,分别激活细胞膜和细胞质中TLR3信号通路,介导抑癌作用。在前期工作的基础上,本文将通过小核酸干扰技术(si RNA)下调HCC细胞中TLR3信号通路中关键性转接蛋白TRIF和NF-κB蛋白水平,深入研究ds RNA激活HCC细胞中TLR3信号通路介导的抑癌作用中TRIF和NF-κB的作用功能。方法(1)用q RT-RCR和Western blot检测不同HCC细胞株(SMMC-7721、Hep G2、97H、97L)中靶基因TRIF和NF-κB m RNA和蛋白表达水平,筛选高表达靶基因的HCC细胞株用于后续实验;(2)构建靶向TRIF和NF-κB基因的si RNA(si TRIF和si NF-κB)及非特异序列的阴性对照si RNA(NC),并在m RNA和蛋白水平分别检测si RNA对HCC细胞中靶基因的沉默效果;(3)研究共分为5组,利用课题组前期已合成的TLR3激动剂BM-06转染HCC细胞株为BM-06组;用BM-06分别联合si TRIF和si NF-κB转染HCC细胞株,分别为BM-06+si TRIF组和BM-06+si NF-κB组;此外Poly(I:C)作为阳性对照组转染细胞(Poly(I:C))和阴性对照的未处理组(Untreated)。(4)用Western blot和免疫荧光检测各组靶基因TRIF和NF-κB的蛋白表达;(5)用qrt-pcr法检测tlr3及信号通路相关因子trif、irf3、ifnβ、tnfα、nf-κb和增值基因cyclind1,以及凋亡相关蛋白caspase-3、caspase8和caspase9mrna的表达;(6)分别用mtt法、tanswell法、hoechst染色、流式细胞术检测hcc细胞增殖、迁移和凋亡;(7)用各处理组癌细胞培养上清混合matrigel培养人脐静脉内皮细胞(huvec)进行体外管形成实验,通过计数成管节点均值比较各组管形成水平。结果(1)不同hcc细胞株(smmc-7721、hepg2、97h、97l)中靶基因trif和nf-κb均有表达,其中在hepg2细胞中靶基因表达最高,与其他细胞比较差异有显著统计学意义(p<0.05)。(2)与未处理细胞比较,hepg2细胞转染sitrif或sinf-κb后,靶基因mrna和蛋白表达显著下降(均p<0.05);(3)bm-06组和poly(i:c)组细胞中靶基因trif和nf-κb蛋白表达均高于未处理细胞的表达水平(p<0.05),并且靶基因蛋白表达在bm-06组和poly(i:c)组间差异无统计学意义(p>0.05);trif和nf-κb蛋白表达在bm-06+sitrif组和未处理细胞间比较差异无统计学意义(p>0.05),说明sitrif阻断了bm-06激活tlr3信号通路中trif的表达,同时阻断了trif下游分子nf-κb的表达。bm-06+sinf-κb组细胞中靶基因trif水平与poly(i:c)组比较差异无统计学意义(p>0.05),而nf-κb蛋白表达与未处理细胞的表达水平比较,差异无统计学意义(p>0.05)。说明sinf-κb下调bm-06激活tlr3–trif下游分子nf-κb的表达。(4)与未处理细胞相比较,bm-06组和poly(i:c)组tlr3及信号通路相关因子trif、irf3、ifnβ、tnfα和nf-κbmrna的表达显著增加(均p<0.05),而bm-06组和poly(i:c)组间差异无统计学意义(p>0.05);bm-06+sitrif组除tlr3水平与poly(i:c)组接近(p>0.05),其他tlr3信号通路相关因子trif、irf3、ifnβ、tnf-α和nf-κbmrna的表达与未处理细胞比较差异无统计学意义(均p>0.05);bm-06+sinf-κb组中仅nf-κb表达与未处理细胞的表达水平比较,差异无统计学意义(p>0.05),其他tlr3及信号通路相关因子表达水平与poly(i:c)组比较无显著差异无统计学意义(均p>0.05)。(5)与未处理细胞相比较,cyclind1mrna水平依次在bm-06+sinf-κb、bm-06组和poly(i:c)组中降低(均p<0.05);而BM-06+si TRIF组中表达水平与未处理细胞的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(6)与未处理细胞相比较,caspase-3、8 m RNA水平依次在BM-06+si NF-κB、BM-06组和Poly(I:C)组中增加(均P<0.05);BM-06+si TRIF组中表达水平与未处理细胞间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。caspase-9 m RNA水平在各实验组略有增加,但与未处理细胞的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(7)与未处理细胞相比较,细胞增殖活性依次在BM-06+si NF-κB、BM-06组和Poly(I:C)组中降低(均P<0.05)。而BM-06+si TRIF组中细胞增殖活性与未处理细胞比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(8)与未处理细胞相比较,细胞迁移能力在BM-06+si NF-κB、BM-06组和Poly(I:C)组中下降(均P<0.05),而BM-06+si TRIF组中迁移能力与未处理细胞相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(9)与未处理细胞相比较,流式细胞仪和Hoechst染色检测细胞凋亡依次在BM-06+si NF-κB、BM-06组和Poly(I:C)组中增加(均P<0.05);而BM-06+si TRIF组对细胞凋亡无明显影响(P>0.05)。(10)与未处理细胞相比较,管形成依次在BM-06+si NF-κB、BM-06组和Poly(I:C)组中显著减少(均P<0.05);而BM-06+si TRIF组对管形成无明显抑制(P>0.05)。结论(1)ds RNA激活TLR3信号通路能有效抑制HCC细胞增殖、迁移,血管形成,并促进细胞凋亡。(2)TRIF作为TLR3信号通路中的关键转接蛋白,ds RNA激活TLR3信号通路介导的抑癌作用依赖于TRIF的表达。(3)NF-κB作为TRIF的下游分子,下调NF-κB的表达水平有利于ds RNA激活TLR3信号通路偏向于细胞受体的凋亡途径。(4)联合使用ds RNA和si NF-κB能更有效的发挥TLR3介导的抑癌作用,达到精准的多靶向的干预HCC目的。