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叶酸（维生素B9）是一种水溶性维生素,是叶酸（蝶酰基单谷氨酸）和具有叶酸生物活性的相关化合物的统称。L-5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）是叶酸在人体内发挥作用的唯一活性形式,能预防新生儿神经管缺陷,并具有防治阿尔兹海默病的作用。然而人体本身并不能自然合成5-MTHF,必须从食物中获取。目前化学法合成5-MTHF及其前体叶酸会造成严重环境污染,导致绿色、可持续5-MTHF供给面临挑战。相比于化学合成,微生物合成法是实现5-MTHF绿色、可持续供给的重要途径。目前微生物法生产5-MTHF主要存在不同形式叶酸比例的调控方法缺乏、关键前体鸟苷5’-三磷酸（GTP）和对氨基苯甲酸（pABA）供给不足以及通过全局代谢调控影响5-MTHF合成的关键基因鉴定困难三方面问题。针对上述问题,本文以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168做为出发菌株,通过强化5-MTHF及二氢叶酸（DHF）合成途径,促进 5-MTHF 的积累;通过 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference（CRISPRi）系统,抑制5-MTHF分解代谢途径及竞争途径,提升5-MTHF合成效率;通过转录组分析全局代谢网络,鉴定影响5-MTHF合成的关键基因,通过靶向调控关键基因促进5-MTHF合成效率提升。本文主要研究成果如下:（1）利用大肠杆菌MG1655的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶MetF代替枯草芽孢杆菌具有5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和同型半胱氨酸S-甲基转移酶双功能活性的YitJ,减少了同型半胱氨酸S-甲基转移酶活性造成的5-MTHF的分解,实现了5-MTHF积累,菌株A2产量达到229.59 μg/L;通过强化表达二氢叶酸还原酶（DHFR）、二氢叶酸合酶/叶酰聚谷氨酸合酶（DHFS/FPGS）以及叶酸蝶呤部分生物合成的第一个限速酶GTP环化水解酶I（GCHI）,增加了中间产物DHF和四氢叶酸（THF）的供给,菌株A8的5-MTHF产量是A2的4.2倍,产量达到960.27 μg/L。（2）通过CRISPRi系统对5-MTHF中间产物参与的分支途径进行抑制,包括中心代谢途径中的pyk和tkt基因,嘌呤代谢途径中的purN、purH和thyA基因,辅酶A合成途径中的panB和ykpB基因以及其他竞争代谢途径中的基因ribA、pheA、tyrA和trpE基因。当抑制靶基因panB、thyA、trpE和pheA时,重组菌株5-MTHF产量提高明显,是出发菌株A8产量的1.3倍,达到1.58 mg/L。通过超高效液相色谱-串联质谱（Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS）检测 5-MTHF及其不同形式叶酸的浓度,结果表明总叶酸产量为3.31 mg/L,是对照菌株A0的8.5倍。菌株A8与A0相比,前体叶酸（folicacid）的比例从41.9%下降到15.7%,目标产物5-MTHF的比例上升到61.8%。（3）开展模块化强化5-MTHF前体GTP和pABA供给的研究,其中模块M1为前体GTP的合成途径,利用不同强度的启动子对模块M1中的基因ndk、gmk、guaA和deoD进行强化表达,鉴定了基因guaA和deoD为模块M1的关键基因;模块M2为前体GTP合成的下游途径,途径中包含基因folE、yciA、phoA、folB和folK,通过基因强化表达及5-MTHF产量分析,鉴定基因phoA和folBK为模块M2的关键基因。对M1中筛选出的关键基因guaA和deoD和M2中的关键基因phoA和folBK进行模块化组装,当组装P6启动子表达的guaA基因以及P10启动子表达的folBK基因时,得到菌株B89的5-MTHF产量最高,达到2.77 mg/L,比对照菌株A9产量（1.72 mg/L）提升60.9%。通过模块化强化前体GTP和pABA途径,平衡了多个模块前体供给,有效促进了 5-MTHF合成。（4）对5-MTHF产量分别在低、中、高水平的三株枯草芽孢杆菌进行转录组分析,统计基因显著上调和下调表达的情况。通过CRISPRi抑制表达50个显著下调的基因,当抑制基因comGB、comGF、thiO、thiD、coiA、thiF、ygaK、comGC、cypX和yhcV时,5-MTHF产量较A9提高10%以上,抑制基因comGB表达的菌株5-MTHF产量最高,达到2.89mg/L;通过强启动子P566过表达25个转录水平显著上调的基因,当过表达基因gatC、yopO、yoqC、yrvD和yciB时,5-MTHF产量较A9提高了 17%以上,强化表达基因yciB的菌株5-MTHF产量最高,达到2.34 mg/L。将筛选出的用于改进5-MTHF生物合成的15个关键基因comGB、comGF、thiO、thiD、coiA、thiF、ygaK、comGC、cypX、yhcV、gatC、yopO、yoqC、yrvD和yciB与模块化强化前体供给的菌株B89相结合,当B89抑制表达基因comGC时,5-MTHF产量较B89提升23.1%,达到3.41 mg/L,是目前微生物法合成5-MTHF所达到的最高产量。