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日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一种重要的人畜共患病原,其宿主范围广泛,可以感染啮齿动物、家畜及人,还可以感染多种传代细胞系。猪是JEV的储存宿主,感染后可导致妊娠母猪流产,产死胎、畸胎、木乃伊胎等,给养猪业造成经济损失。此外,JEV还可以通过蚊虫叮咬传播给人,造成感染者瘫痪甚至死亡。因此,深入研究JEV的致病机制具有重要的公共卫生学意义。本实验室2008年-2011年在国内部分规模化猪场开展的血清学调查结果显示,我国猪群中JEV抗体阳性率普遍较高,且现阶段JEV流行优势毒株与传统疫苗毒株间已存在较大差异。目前有关JEV的致病机制尚未完全阐明,本研究以细胞自噬现象为切入点,围绕病毒复制与细胞自噬的相关性展开研究,旨在从先天性免疫角度为JEV分子致病机制的研究提供新线索。运用透射电镜、Western Blot和激光共聚焦免疫荧光等技术,对JEV疫苗株SA14-14-2感染后BHK-21、PK-15和N2A细胞的自噬活性分别进行了定性检测和定量分析。结果显示,JEV感染可导致3种宿主细胞胞浆内产生大量双层膜和单层膜的自噬体样囊泡,同时胞内自噬体标志分子LC3-Ⅱ含量、LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化量以及宿主细胞的自噬流量均显著提高；JEV感染后,宿主细胞内LC3信号大量增加,呈点状聚集,且该信号能与JEV非结构蛋白NS1发生共定位。以上结果表明,JEV感染能够诱导多种宿主细胞发生自噬。利用自噬诱导剂Rapamycin、自噬抑制剂3-MA及特异性siRNAs改变宿主细胞的自噬活性,而后接种JEV,检测病毒在细胞中复制能力的变化。结果显示,Rapamycin诱导细胞自噬后,感染细胞内外的病毒滴度显著增加,而用3-MA或siRNA抑制细胞自噬活性后,感染细胞内外的病毒滴度显著降低。结果表明,宿主细胞自噬活性的改变影响了病毒在细胞中的增殖过程,且自噬活性的增加有利于JEV在细胞中的增殖。以PCMV为载体,构建JEV结构蛋白和非结构蛋白共9个真核表达重组质粒,分别转染BHK-21细胞,分析病毒蛋白与BHK-21细胞白噬发生的相关性。结果显示,JEV结构蛋白C、M及非结构蛋白NS3的表达能够提高细胞内自噬标志分子LC3-Ⅱ的含量及自噬体样囊泡的数量,且蛋白标签与细胞内LC3呈现共定位信号。提示,JEV结构蛋白C、M及非结构蛋白NS3是病毒诱导细胞自噬的主要蛋白。应用siRNA干扰技术及激光免疫共聚焦技术,分析了表达JEVSA14-14-2各蛋白的293T细胞中自噬参与蛋白IRGM在病毒复制中的可能作用。结果表明,自噬参与蛋白IRGM的沉默表达,可以显著降低病毒在细胞中的增殖滴度,且IRGM能够与JEVNS3发生明显共定位。综上所述,本研究首次发现并证实了JEV能够诱导宿主细胞发生自噬,且细胞自噬的发生有利于JEV在细胞中的进一步增殖；病毒的结构蛋白C、M及非结构蛋白NS3在诱导细胞自噬过程中发挥主要作用。研究结果为解析JEV与宿主细胞的相互作用提供了线索,也为JEV分子致病机制研究开辟了新的思路。