目的：研究温州医学院附属第二医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的耐药情况及β-内酰胺酶基因型的分布情况；了解Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合子在产ESBLs肺炎克雷伯菌中的分布；探讨亚抑菌浓度头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶对产ESBLs肺炎克雷伯菌质粒接合转移的影响，为预防和控制产ESBLs肺炎克雷伯菌耐药性传播和发展，减缓细菌耐药提供科学依据。 方法： 1.收集温州医学院附属第二医院2005年1月～2006年12月从临床各类标本中分离出的产ESBLs肺炎克雷伯菌株，采用Kirby-Bauer(K-B)琼脂扩散法进行药敏试验，用纸片协同试验法初步检测肺炎克雷伯菌产ESBLs的情况； 2.用碱裂解法提取临床分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌株的质粒，观察其质粒图谱，分析同一病区内质粒图谱的特点； 3.采用聚合酶链反应(PCR)法扩增β-内酰胺酶基因，其引物包括SHV、TEM、CTX-M、OXA、PER、VEB，并取部分阳性产物进行测序，确定β-内酰胺酶基因型； 4.以特异引物分别扩增Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因及Ⅰ类整合子相关基因盒，以确定其在产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分离株中的分布； 5.取临床分离的产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌(E.coliC600SMRLac-)进行肉汤接合试验。研究不同亚抑菌浓度(0、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)的头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶等抗生素在不同作用时间(2h、4h、6h、8h、10h)下对产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌质粒接合转移的影响。 结果： 1.2005年1月～2006年12月间，自临床各类标本中共分离出108株产ESBLs肺炎克雷伯菌。主要的标本来源为痰液，共85株，占78.7％。主要的科室来源为ICU，有45株，占41.7％。药敏试验结果显示，108株产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南最敏感，耐药率为0％，其次分别为哌拉西林/他唑巴坦，耐药率为0.9％，头孢哌酮/舒巴坦，耐药率为8.3％，环丙沙星的耐药率为16.7％，头孢西丁的耐药率为19.4％。对磺胺类等抗生素耐药率较高，对三代头孢菌素全部耐药。 2.质粒DNA电泳结果显示，产ESBLs肺炎克雷伯菌质粒谱较不均一。63株产ESBLs肺炎克雷伯菌分别携带1～5个质粒，最大的质粒长度超过23kb，最小的质粒在1kb左右。同一病区在相近时间内分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌的质粒图谱较相似。某些大质粒出现频率较高，如约23kb大小的质粒在47株(74.6％)产ESBLs肺炎克雷伯菌中出现。 3.PCR检测结果显示：63株产ESBLs肺炎克雷伯菌扩增出SHV型β-内酰胺酶基因阳性产物为41株，阳性率为65.1％；TEM型为51株，阳性率为81.0％；OXA型为20株，阳性率为31.8％；CTX-M型为50株，阳性率为79.4％；未检出VEB型和PER型β-内酰胺酶基因。取部分PCR扩增阳性产物进行测序，SHV型β-内酰胺酶基因的序列是SHV-11，发现TEM型β-内酰胺酶基因的序列是TEM-1。同时发现同一菌株携带多基因的现象，在本研究中49.2％的产ESBLs分离株携带至少2种β-内酰胺酶基因。 4.108株产ESBLs肺炎克雷伯菌中，共检出58株携带Ⅰ类整合子，阳性率53.7％，未检测到Ⅱ类和Ⅲ类整合子。在58株Ⅰ类整合酶阳性的产ESBLs肺炎克雷伯菌中，共有52株携带整合子相关基因盒，阳性率89.7％，基因盒总数为5种。部分分离自同一科室的菌株携带片段大小相同的基因盒。产ESBLs肺炎克雷伯菌整合子阳性株除对氦苄西林及哌拉西林的耐药率与整合子阴性株的差异无统计学意义以外(P＞0.05)，对其他抗生素的耐药率均明显高于整合子阴性株(Jp＜0.05)。 5.不同亚抑菌浓度的头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶抗生素对产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌耐药质粒接合转移的影响； 1)研究发现各头孢西丁浓度组对耐药质粒接合转移率的差异无统计学意义(P＞0.05)。头孢西丁作用的时间对质粒接合转移率的差异有统计学意义(P＜0.05)。其中在头孢西丁作用6h后的接合转移率最高。头孢西丁浓度与作用时间之间无交互作用(P＞0.5)。 2)各头孢他啶、头孢噻肟浓度组对耐药质粒接合转移率的差异有统计学意义(P＜0.05)，且随头孢他啶、头孢噻肟浓度增加而接合转移率随之下降。头孢他啶作用的时间对质粒接合转移率的差异有统计学意义(P＜0.05)。其中在头孢他啶作用10h后的接合转移率最高，其次为6h。而头孢噻肟作用的时间对质粒接合转移率的差异无统计学意义(P＞0.5)。但在头孢噻肟作用6h后的接合转移率最高。头孢他啶、头孢噻肟浓度与作用时间之间无交互作用(P＞0.5)。 3)头孢西丁、头孢噻肟、头孢他啶对细菌形态的影响：革兰染色发现生长对照组的产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌在培养过程中一直维持其原有的形态，加了头孢西丁的菌液培养过程中，形念变化也不明显。而大部分加头孢他啶、头孢噻肟的菌液培养后，细菌形态发生了显著的变化，细菌菌体变大，长度加长，宽度也变宽，只有少数菌体维持原来的形态。其中培养6h后菌体形态变化最明显，呈长丝状。不同亚抑菌浓度的头孢他啶、头孢噻肟对细菌形态变化存在差异，其中以1/16MIC的作用最为明显。 结论： 1.我院产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的感染以呼吸道为主，科室来源以ICU最为常见。 2.本研究中产ESBLs肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素全部耐药，对磺胺类耐药率也较高，但对亚胺培南全部敏感。 3.产ESBLs肺炎克雷伯菌质粒谱较不均一，大质粒出现频率较高，对细菌耐药性在人群中的传播起一定的作用。 4.本研究中产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药基因以TEM型，CTX-M型为多见，同时存在同一菌株携带多基因的现象，这有可能是细菌抵御多种抗生素攻击的机制之一。 5.Ⅰ类整合子及相关基因盒在产ESBLs肺炎克雷伯菌临床分离株中分布广泛，它的存在可能会增加ESBLs菌在临床菌株中的水平散播，造成多重耐药株在院内流行。 6.本研究中不同亚抑菌浓度的头孢西丁对产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌接合转移的影响不明显。不同亚抑菌浓度的头孢他啶、头孢噻肟对产CTX-M型ESBLs肺炎克雷伯菌接合转移有一定的影响，其中以1/16MIC亚抑菌浓度头孢他啶、头孢噻肟产生的影响最为明显。