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胚胎在早期发育过程中,其形态和生理会发生很多的变化,包括对后期胚胎发育潜能起决定作用的第一次卵裂、合子基因组的激活、桑葚胚的致密化和囊胚的形成等。这些转变过程往往都伴随着与发育相关基因的差异表达与调控,对猪卵母细胞激活及孤雌胚发育进行研究的目的,正是为了更好的了解哺乳动物胚胎早期发育过程中基因差异表达的情况,以期为哺乳动物胚胎发育分子调控机制的研究提供参考。同时这对深入细致地研究动物克隆技术,建立孤雌哺乳动物品系以及加速家畜育种进程等均具有重要意义。
猪胚胎培养的相关资料显示,现在的体外培养条件不能完全模拟体内的环境[l]。因此,通过比较同一类细胞在不同生理状态下或在不同生长发育阶段的基因表达差异,可为分析生命活动过程提供重要信息。为了鉴别和分离早期孤雌发育的胚胎表达差异的基因,了解体外产生的早期胚胎mRNA表达模式,本研究主要利用了DDRT-PCR(differential display reversetranscription polymerase chain reaction,DDRT-PCR)技术,来分析猪体外成熟的早期孤雌激活胚,包括2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、桑葚胚以及囊胚等四个时期的胚胎mRNA的表达,并且需分离得到各个时期特异性表达的基因片段。为此,我们分别提取了猪早期发育的2-细胞胚胎(60个)、4-细胞胚胎(60个)、桑葚胚(63个)以及囊胚(61个)的总RNA,按照应有的体系反转录。然后将各个时期的反转录产物进行PCR扩增,经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分离并银染后,回收共得到22条早期胚胎的差异表达片段,其中仅有11条在二次扩增时可以重复出现,最终对10个差异表达基因进行了克隆并送去测序。将8个测序结果经过BLAST比对后发现,有7条差异表达片段分别比对上了人上皮型钙粘附蛋白(E-cadherin)基因、欧洲野猪的CWF19-L2基因、小鼠Amdl(adenosylmethionine decarboxylase l)基因、欧洲野猪ND4(NADHdehydrogenase subunit4)基因。其中Amdl基因在2-细胞、4-细胞期表达;ND4基因在桑葚胚、囊胚期表达基因;CWF19-L2在桑葚胚时期表达;E-cadhefin基因在囊胚期表达;片段F1未发现相似性序列,为新的EST。