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深绿卷柏(Selaginella doederleinii)为蕨类植物门卷柏科药用植物,在我国境内分布广泛,资源丰富。深绿卷柏具有消炎解毒,驱风消肿,抗癌止血等功效,民间有用其治疗肿瘤的报道。目前对深绿卷柏的研究仍不够系统和深入,本文通过初步筛选发现深绿卷柏乙酸乙酯部位抗肿瘤活性明显强于其它部位,因此本课题主要针对乙酸乙酯部位,深入研究其抗肿瘤作用机制和药效物质基础。目的:对深绿卷柏乙酸乙酯部位体内外抗肿瘤活性及其可能的分子作用机制进行研究。方法:采用HPLC图谱对深绿卷柏乙酸乙酯部位的主要成分进行分析;以DU145,Hep G2,He La,A549,PC12,Vero细胞为受试细胞株,采用MTT法检测深绿卷柏乙酸乙酯部位提取物体外抗肿瘤活性;倒置显微镜观察药物作用前后Hep G2,DU145,MCF-7以及PC12细胞的形态学变化;以深绿卷柏乙酸乙酯部位提取物为实验对象,以Hep G2为受试细胞株,流式细胞术检测深绿卷柏乙酸乙酯部位提取物诱导Hep G2细胞凋亡的凋亡率;通过RT-PCR法检测药物作用前后细胞cox-2、5-lox、flap、12-lox、bcl-2、bax、caspase-3、survivin基因m RNA表达水平,从基因水平探讨其作用机制;以接种H22肝腹水瘤的昆明小鼠为实验对象,研究深绿卷柏提取物的体内抑瘤作用。采用Autodock 4.2软件对深绿卷柏乙酸乙酯部位6个主要双黄酮类成分与cox-2、5-lox、12-lox、15-lox进行分子对接,以验证RT-PCR结果。结果:(1)通过HPLC色谱分析结合文献的色谱位移值分析得到深绿卷柏乙酸乙酯部位主要成分为穗花杉双黄酮、罗波斯塔黄酮、2′′,3′′-二氢-3′,3′′′-双芹菜素、3’,3’’’-双柚皮素、橡胶树双黄酮、7,4′,7",4"’-四-0-甲基-穗花杉双黄酮。(2)MTT法结果表明,深绿卷柏乙酸乙酯提取物能抑制癌细胞增长,抑制率呈现浓度依赖性,对正常细胞和PC12细胞细胞毒作用较小。(3)形态学变化:倒置显微镜观察深绿卷柏乙酸乙酯部位提取物作用于Hep G2,DU145,MCF-7细胞后引起细胞表面皱缩,体积变小,细胞膜完整性丧失,细胞之间间隙变大密度变小,细胞大量死亡等细胞凋亡特征;深绿卷柏乙酸乙酯部位对于PC12细胞的细胞毒作用比阳性药5-氟尿嘧啶明显要小,且对于癌细胞比正常细胞更敏感。(4)流式双染法结果表明随着深绿卷柏乙酸乙酯提取物能诱导Hep G2细胞凋亡且随着其浓度增高,细胞凋亡率呈上升趋势。(5)荧光定量PCR实验结果显示随着深绿卷柏乙酸乙酯部位提取物作用时间的延长,Hep G2细胞内5-lox、cox-2、flap、12-lox基因m RNA表达量降低,bcl-2、survivin基因m RNA表达量降低,同时bax、caspase-3基因m RNA表达量增加。(6)体内动物实验:深绿卷柏提取物低中高剂量组抑制H22肝腹水瘤老鼠肿瘤生长的抑瘤率分别为23.3%、39.8%、57.7%,与阳性药相比深绿卷柏提取物对荷瘤小鼠毒副作用较小。(7)计算机模拟分子对接结果显示穗花杉双黄酮、2′′,3′′-二氢-3′,3′′′-双芹菜素、3’,3’’’-双柚皮素与cox-2、5-lox和12-lox亲和力较强。结论:深绿卷柏乙酸乙酯提取物在体内外均具有抗肿瘤作用,体外细胞实验表明深绿卷柏在体外具有广谱的抗肿瘤活性、能诱导肿瘤细胞凋亡,其诱导癌细胞凋亡的机制可能与深绿卷柏乙酸乙酯提取物能影响与肿瘤发生发展相关的炎症因子cox-2、5-lox、flap、12-lox以及凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3、survivin的m RNA表达有关。