【摘 要】
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O连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是连接在蛋白质丝氨酸或苏氨酸羟基侧链上的单糖修饰,在众多重要的生物途径中该修饰都起到重要作用。蛋白质O-GlcNAc修饰的分子量小、在质谱检测中带电量极低、并且通过质谱方法无法和N-乙酰半乳糖胺（Gal NAc）相区分,所以O-GlcNAc修饰蛋白的高特异性、高亲和力识别工具和简便易行的定量方法的开发一直是O-GlcNAc修饰蛋白功能研究领域的研究瓶颈
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O连接的N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是连接在蛋白质丝氨酸或苏氨酸羟基侧链上的单糖修饰,在众多重要的生物途径中该修饰都起到重要作用。蛋白质O-GlcNAc修饰的分子量小、在质谱检测中带电量极低、并且通过质谱方法无法和N-乙酰半乳糖胺（Gal NAc）相区分,所以O-GlcNAc修饰蛋白的高特异性、高亲和力识别工具和简便易行的定量方法的开发一直是O-GlcNAc修饰蛋白功能研究领域的研究瓶颈。本论文以产气荚膜梭菌N-乙酰葡萄糖胺酶突变体(Clostridium perfringens OGAD298N,CpOGAD298N)对O-GlcNAc修饰蛋白的识别和富集为基础,全面鉴定了该突变体的糖结合活性（糖芯片检测）,富集鉴定了乳腺癌细胞MCF-7和Balb/c小鼠肝脏组织中的O-GlcNAc修饰蛋白。并以CpOGAD298N对O-GlcNAc修饰的高特异性、高亲和性结合能力为基础,结合邻位连接检测（Proximity ligation assay,PLA）建立了体系内确定O-GlcNAc修饰蛋白的绝对定量方法。第一部分:CpOGAD298N糖结合活性检测我们克隆并表达纯化了产气荚膜梭菌N-乙酰葡萄糖胺酶突变体(Clostridium perfringens OGA mutant,CpOGAD298N),将该蛋白送至美国糖功能组学研究中心（Consortium for Functional Glycomics,CFG）进行了糖芯片的结合鉴定。将CpOGAD298N的糖芯片结果进行R软件热图分析并和目前应用得较为广泛的O-GlcNAc修饰抗体CTD110.6和O-GlcNAc修饰结合的麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）的糖芯片结果进行了比对,结果发现CpOGAD298N结合的糖结构绝大部分都是GlcNAc修饰结尾的,几乎不结合Gal NAc结尾的糖结构。等温量热滴定实验（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）也证明CpOGAD298N对GlcNAc和Gal NAc的区分能力。以上结果初步说明了CpOGAD298N对O-GlcNAc修饰蛋白的高特异性、高亲和性结合能力。第二部分:CpOGAD298N富集O-GlcNAc修饰蛋白依据CpOGAD298N对O-GlcNAc修饰蛋白的高特异性、高亲和性结合能力的初步验证,我们进一步使用带GST标签的CpOGAD298N在免疫印迹水平识别O-GlcNAc修饰蛋白,探究了在远距离免疫印迹实验时CpOGAD298N的合适用量,并发现了CpOGAD298N对O-GlcNAc修饰蛋白的识别能力可以被GlcNAc单糖封闭。经流式细胞术实验验证,biotin标记的CpOGAD298N对多种细胞表面的染色结果表明CpOGAD298N对细胞表面几乎无结合能力。Biotin标记的CpOGAD298N对固定、透化后的细胞结合能力高,且结合能力随着CpOGAD298N浓度的升高而增强。激光共聚焦显微镜观察结果显示CpOGAD298N结合的蛋白全部分布在细胞内。蛋白质O-GlcNAc修饰被报道绝大部分分布在细胞核和细胞质内,所以CpOGAD298N对细胞蛋白的结合情况与O-GlcNAc修饰的分布情况相符。CpOGAD298N-Sepharose 4b亲和柱从乳腺癌细胞系MCF-7中富集到82个蛋白的84个高置信度O-GlcNAc修饰肽段,从Balb/c小鼠肝脏组织中富集到33个蛋白的33个高置信度O-GlcNAc修饰肽段。这些蛋白大部分是新的O-GlcNAc修饰蛋白,且不结合麦胚凝集素（Wheat germ agglutinin,WGA）。第三部分:O-GlcNAc修饰蛋白定量鉴定新方法的建立:除O-GlcNAc修饰肽段富集外,本论文还以CpOGAD298N对O-GlcNAc修饰蛋白的结合能力为基础,结合邻位连接检测（Proximity ligation assay,PLA）技术构建了确定O-GlcNAc修饰蛋白的定量方法,该方法被成功应用于MCF-7细胞内His标签组蛋白H2B的定量检测,检测灵敏度低至飞摩尔级。使用合适的邻位连接检测探针分子,此定量方法可被用于体系内任意微量O-GlcNAc修饰蛋白的定量检测,为动态O-GlcNAc修饰的定量研究提供了非质谱仪依赖的简便易行的方法。
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