黄曲霉毒素、伏马菌素是谷物中常见的两种真菌毒素，其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉菌与寄生曲霉菌产生的一类次级代谢产物，被认为是当前已知毒性最强的真菌毒素，能够通过DNA损伤而引起突变，并能导致诱发性肝癌；伏马菌素B1(FB1)为伏马菌素的主要组分，具有肝毒性和肾脏损害作用，同时与人类食道癌的发病率具有一定的关系。鉴于两种毒素经常共存于各种谷物及其制品中，且靶细胞都是肝细胞，本实验采用人肝癌细胞HepG2为对象，研究了AFB1与FB1的联合毒性，探讨了两种毒素单独与混合作用于HepG2时的凋亡途径。为深入研究多种真菌毒素共存时对总体毒性的影响及其联合作用机制提供基础，并为危险性的评价提供参考。主要研究结果如下：以处在对数生长期的HepG2细胞为研究对象，采用不同浓度梯度的AFB1(0.1、10、50、100μmol/L)和FB1(0.1、7、14、70μmol/L)进行单独或者混合处理，通过测量细胞活性、ATP含量、DNA受损程度、线粒体膜通透性以及活性氧含量的变化，分析这两种毒素对HepG2细胞联合作用的类型。结果显示，在SRB实验中，混合毒素对于HepG2细胞抑制率的理论加和值与实际测量值的比值大都接近于1，其他四个指标的理论加和值与实际值相比，无显著性差异（p>0.05），且两种毒素对细胞的混合毒效应均高于单独作用组。故得到结论，黄曲霉毒素B1和伏马菌素B1对人肝癌HepG2细胞的联合毒性作用为加和作用。选取AFB1、FB1及AFB1+FB1三个毒素组中对HepG2抑制率分别达到10%、30%、50%时对应的浓度，与细胞作用48h后，观察HepG2细胞核形态、凋亡率、周期分布及线粒体膜电位的改变。结果显示，与AFB1及FB1各浓度组毒素反应48h后，共聚焦显微镜观察到， HepG2细胞核出现碎块状致密浓染或半月形凝聚等凋亡现象；在细胞凋亡率的测定中，AFB1、FB1混合及单独组均能引起HepG2不同程度的凋亡，与对照组相比均存在极显著性差异（p<0.01），且各组的凋亡率与毒素呈现出浓度依赖关系；细胞周期测定结果表明，FB1主要影响G0/G1期，AFB1及AFB1+FB1主要影响S期；JC-1测量线粒体膜电位的结果显示，在两毒素单独及混合作用于HepG2细胞48h后，细胞内线粒体膜电位与对照组相比都出现不同程度的降低，且同一组中，膜电位下降的程度随着毒素浓度的增加而增大。经独立样本T检验分析，三个毒素组导致的细胞凋亡率及线粒体膜电位的下降程度均无显著性差异（p>0.05），进一步验证了两种毒素的联合作用为加和作用。采用免疫组化法测定了caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2、bcl-x及p53等细胞凋亡相关蛋白的表达，并分析了三组毒素导致HepG2凋亡的分子机理，结果显示，AFB1、FB1及AFB1+FB1均是在p53蛋白的调控下，一方面利用死亡受体激活凋亡启动子caspase-8和执行子caspases进入凋亡程序；另一方面，毒素刺激会导致HepG2细胞内促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降，线粒体膜电位下降，释放细胞色素C并活化启动子caspase-9及执行子，最终通过蛋白酶水解而使细胞崩溃。