新城疫(Newcastle Disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的对世界养禽业危害极为严重的一种传染病。新城疫病毒是副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的唯一成员。P蛋白是P基因编码的三种蛋白产物中唯一参与病毒复制的病毒蛋白,也是RNA聚合酶的成份之一。一般认为,磷蛋白的磷酸化水平对其生物学功能起着至关重要的作用,但是由于技术水平的限制,NDV磷酸化位点及其相关生物学的研究才刚刚起步。为了确定新城疫病毒P蛋白中具有重要生物学意义的磷酸化位点并深入分析其功能,本文在生物信息分析结合特异蛋白激酶抑制剂实验的基础上,以La Sota的微型基因组为平台,利用不同磷酸化位点缺失的P蛋白真核表达质粒作为辅助质粒,根据报告基因表达量、基因组RNA、反向基因组RNA以及mRNA水平的波动,筛选出其中重要的功能性位点,并综合分析磷酸化对病毒复制和转录过程的影响,对研究NDV在宿主细胞内的增殖调控和致病机理有重要的理论意义。一、新城疫病毒P蛋白潜在磷酸化位点分析根据磷酸化位点保守性的理论,利用生物信息学的方法比对了28株新城疫病毒的P基因序列,随后利用磷酸化位点预测结合激酶作用基序比对以及功能结构域分析等三重评价标准,最终筛选出了7个潜在的磷酸化位点。结果显示,这7个潜在磷酸化位点分布于P蛋白所有的功能结构域,可能是在宿主的PKC激酶作用下被磷酸化,该预测结果与其他副粘病毒的研究进展一致。二、宿主细胞磷酸激酶在新城疫病毒感染中的作用为了验证磷酸化通路在新城疫病毒感染中的作用,本实验使用多种蛋白磷酸激酶抑制剂和激活剂预处理细胞,比较NDV生长状况的差异。结果显示NDV在PKC激酶抑制剂处理的细胞上生长受到抑制,而这种抑制作用能被PKC激酶激活剂中和。通过PKC激酶抑制剂的细胞毒性试验证实,这种抑制作用不是由于药物对细胞的毒性或因改变培养基的pH值造成的。病毒在staurosporine处理的细胞上的增殖实验显示,20 nmol/L至200 nmol/L的staurosporine都能对病毒感染产生抑制作用。本研究表明PKC磷酸化通路在NDV的感染过程中发挥了重要作用。三、新城疫病毒P蛋白磷酸化位点缺失对其功能的影响本研究根据生物信息学的预测结果,利用overlap PCR的方法构建了11条不同磷酸化位点缺失的P蛋白真核表达质粒。以La Sota的微型基因组为平台,根据报告基因表达量、基因组RNA、反向基因组RNA以及mRNA水平的波动,筛选出111位是P蛋白的主要功能性磷酸化位点。当该位点缺失时,mRNA合成量明显下降。但反义基因组RNA始终维持在恒定的水平。该实验结果P蛋白功能性磷酸化位点的磷酸化主要影响病毒基因组的转录过程,当该位点被去磷酸化时转录过程被抑制,而复制过程并不受影响。我们推测P蛋白的功能性磷酸化位点的磷酸化状态可能是调控复制和转录功能切换的“开关”。本研究首次在新城疫病毒P蛋白中鉴定出了功能性的磷酸化位点,并从磷酸化的角度探讨NDV磷蛋白对病毒转录和复制的调控作用。该研究将对我们深入了解病毒的复制和转录机制有着极其重要的意义。