论文部分内容阅读
目的:在过去的几十年中,基于测序技术和计算生物学的巨大进步,越来越多的研究表明,哺乳动物基因组中的非编码区域多数富含产生蛋白质的功能元件。其中,许多RNA过去被标注为非编码的RNA,实际上它们都含有小的开放阅读框(small open reading frames,sORF),而这些sORF可能具有编码小蛋白的能力。这类小蛋白往往不超过100个氨基酸,被称为微小肽(micropeptide)。一些微小肽已被发现并被证实在多种生物过程中发挥着重要作用。脂滴(lipid droplet)是一种独特的细胞器,由单层磷脂膜及其外周蛋白包被中性脂,保守存在于细菌到人的所有物种中。更为重要的是,脂滴与细胞内脂质稳态的维持,以及人类代谢疾病的发生发展有着十分紧密的关系。然而,脂滴上是否存在微小肽仍然未知。因此,本项研究系统探索骨骼肌细胞脂滴上微小肽及其可能具有的生物学功能。方法:围绕上述研究目标,本课题从纯化的脂滴入手,富集其小分子量蛋白;利用质谱学方法,结合微小肽数据库,对脂滴上可能的微小肽进行鉴定;进一步对这些微小肽的细胞内定位进行筛选;对于定位于脂滴的微小肽,研究其对脂质贮存、胰岛素信号的影响。具体而言:1.质谱研究数据库的建立。利用生物信息学方法,筛选提取Gencode数据库中非编码转录本,预测其含有开放阅读框的序列,从而建立小鼠非编码RNA编码数据库。用于后续进行质谱分析中的蛋白检索。2.脂滴的分离纯化。利用本实验室成熟的脂滴分离纯化方法,对小鼠骨骼肌细胞C2C12中的脂滴进行纯化,并利用银染、免疫印迹的方法,对纯化脂滴的纯度进行验证。3.脂滴上小分子量蛋白的富集及质谱鉴定。对纯化的高质量脂滴,进行12%Bis-Tris电泳胶分离。对17 kDa以下的蛋白,进行切胶富集,结合构建的小鼠非编码RNA编码数据库,进行质谱分析,从而鉴定脂滴上的微小肽。4.微小肽细胞内定位筛选。将上述筛选得到的微小肽,构建C端融合GFP荧光标签的质粒,转染Huh7细胞和C2C12细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜观察其是否定位脂滴,从而筛选定位于脂滴的微小肽。同时,对定位脂滴的微小肽,利用生物信息方法,构建其相应的截短体与GFP的融合蛋白,通过激光扫描共聚焦显微镜观察截短体的定位,寻找可能的脂滴定位序列。5.微小肽稳定性调控研究。利用蛋白酶体抑制剂,以及分子生物学方法,对可能参与泛素化的赖氨酸位点进行突变,研究微小肽降解的可能途经及关键位点。6.定位脂滴微小肽的确认。对筛选得到可能定位脂滴的微小肽,构建稳定表达的细胞株,利用细胞组分分析、免疫荧光、免疫电镜技术,对其细胞内定位进行进分析。7.微小肽内源性表达确认。利用CRISPR-CAS9基因编辑技术,构建在目标微小肽终止密码子之前原位敲入3×FLAG-HA标签的稳定细胞株,利用免疫沉淀和免疫印迹实验检测微小肽的内源性表达。8.微小肽功能的研究。利用甘油三酯检测试剂盒,以及饱和脂肪酸刺激的胰岛素抵抗模型,研究目标微小肽对骨骼肌细胞中甘油三酯贮存,以及胰岛素灵敏性的影响。即利用油酸处理过表达微小肽的骨骼肌细胞以及对照组细胞,比较其甘油三酯的变化;用油酸和/或棕榈酸处理过表达微小肽的细胞和对照细胞12小时后,加入胰岛素刺激细胞10分钟,通过免疫印迹实验检测两种细胞中磷酸化AKT(pAKT)蛋白的变化,分析微小肽对胰岛素信号的影响。结果:1.我们发现了44个可能定位于脂滴的微小肽,这些微小肽主要由被注释为processed_transcript,以及retained_intron的转录本编码。2.构建的微小肽GFP融合蛋白观察结果,筛选得到2个定位脂滴的微小肽,将其命名为LDANP1和LDANP2。3.经过蛋白酶抑制剂MG132处理,LDANP1表达量显著增加,表明LDANP1的稳定性是通过蛋白酶体调控的,其中第7、49、61位赖氨酸可能对于LDANP1的泛素化进而通过蛋白酶体进行降解,起着重要的作用。4.细胞组分分析结果表明,LDANP1主要富集在脂滴组分中;免疫荧光结果显示,LDANP1围绕在脂滴周围;免疫胶体金结果表明,金颗粒主要出现在脂滴周围,这些结果进一步确认LDANP1定位在脂滴上。5.通过CRISPR-CAS9基因编辑技术,构建了敲入3×FLAG-HA标签的LDANP1细胞株,确认了LDANP1的内源性表达。6.LDANP1过表达,油酸处理后,骨骼肌细胞中甘油三酯含量显著减少;同时,饱和脂肪酸处理骨骼肌细胞,引起胰岛素刺激下AKT磷酸化的显著下降,油酸能够恢复棕榈酸所降低的AKT的磷酸化,但过表达LDANP1后,这种恢复作用显著减弱。这些结果表明,LDANP1在骨骼肌细胞的甘油三酯贮存,以及胰岛素信号敏感性调控中,起重要作用。7.LDANP2的截短体实验表明,LDANP2的35-56截短体和36-56截短体,只相差一个氨基酸残基,却分别表现出脂滴和线粒体两种不同的定位。结论:本课题通过从分离纯化的脂滴入手,采用质谱方法,结合微小肽数据库,在骨骼肌细胞脂滴上发现了44个微小肽,并确认了LDANP1的内源性表达,通过多种方法确认了LDANP1在脂滴上的地位,进一步发现LDANP1能够影响骨骼肌细胞甘油三酯的贮存以及胰岛素信号。此外,有意思的是,我们发现,LDANP2不同截短体定位不同细胞器。这是首次系统研究脂滴上微小肽的存在及其功能,本课题能够为寻找崭新的脂滴蛋白,研究脂滴蛋白定位、调控脂滴变化的机制,探索影响骨骼肌细胞脂代谢、胰岛素灵敏性的生物活性分子,提供很好的线索。