铁对许多基本的生物反应过程都是必需的,例如DNA的合成、呼吸作用、三羧酸循环等。虽然铁对生命过程是必需的,但是细胞内的铁浓度过高会引发Haber-Weiss反应而产生高活性的自由基,从而对细胞产生毒害作用。大部分细菌通过铁吸收调控蛋白（Ferric uptake regulator,Fur）来精细地调控细胞中的铁浓度。最近在格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense） MSR-1中发现并鉴定了fur基因。MSR-1 Fur直接调控参与铁转运和细胞氧代谢的关键基因的表达,同时在磁小体的合成中起重要作用。MSR-1 fur也能够回补E. coli的fur基因缺失的表型。本实验室解析了未被金属离子激活的MSR-1 Fur （apo-Fur）的结构,其由N端的DNA结合结构域（DBD）和C端的二聚化结构域（DD）,以及连接两个结构域的铰链区（Hinge）组成。在晶体结构中,MSR-1 apo-Fur形成不依赖于金属离子的二聚体。在以上研究结果的基础上,本研究利用凝胶过滤层析和分析超速离心实验证明,溶液中MSR-1 apo-Fur也是形成不依赖于金属离子的二聚体。利用DNase Ⅰ足迹法证明MSR-1 Fur能够特异性地识别二价铁转运系统基因feoABl的启动子上一段25 bp的序列（feoAB1 operator）,同时EMSA实验证明MSR-1 Fur只有在Fe2+存在的条件下才能结合feoABl operator和E. coli Fur box。本研究进一步解析了金属离子激活的MSR-1 Fur （holo-Fur）的结构,发现MSR-1 Fur含有两个金属离子结合位点,分别是位于DBD和DD之间的S1和位于DD内部的S2。两个位点都形成六配位的八面体,其中S1位点对于金属离子的结合能力强于S2。虽然在体外S2对DNA的结合不是必需的,但是在体内这两个金属离子结合位点对于MSR-1 Fur的功能都是必需的。金属离子结合MSR-1 Fur后诱导Fur发生构象变化,使DBD上识别DNA的α螺旋处于合适的位置,从而使MSR-1 Fur获得了结合DNA的能力。为了解释Fur识别DNA的分子机制,本研究还分别解析了MSR-1 Fur与feoABl operator以及MSR-1 Fur与E. coli Fur box的蛋白-DNA复合物结构,并结合生化分析和体内实验证明：MSR-1 Fur主要利用Arg57来特异性地识别碱基G,同时Lys15插入到一段宽度变窄、表面负电荷加强的DNA小沟中,形成增强的电荷作用；计算模拟发现这段DNA小沟的变窄是由DNA序列的内在性质决定的,即Lys15特异性地识别DNA小沟构象。通过与其它细菌的Fur结构比较发现,DBD上参与DNA互作的关键氨基酸残基很保守,并且空间结构上的位置相同,预示细菌中Fur识别DNA的机制很保守。以上研究结果为阐明细菌中Fur是如何被金属离子激活以及激活后的Fur是怎样特异性地识别目的DNA的分子机制提供了结构生物学证据。解旋酶是一类能够利用水解ATP产生的能量,沿着核酸移动并解开DNA或者RNA双链的酶,是生物体内分布最广的一类酶,在许多生物过程中起重要作用。所有的细胞生物和很多病毒都编码解旋酶。根据解旋酶的一级序列特征将其分为六个超家族（SFI-SF6）。目前对于SF1解旋酶的理解主要来自对细胞生物解旋酶的结构和功能研究。解旋酶是尼多病毒进化上最保守的两个非结构蛋白之一,对马动脉炎病毒（Equine arteritis virus, EAV）解旋酶nsp10的研究发现其属于SF1超家族。EAV nsp10对于病毒的基因组RNA和亚基因组RNA的合成是必需的,其N端含有独特的锌结合结构域ZBD （zinc binding domain）,是尼多病毒所独有的,不存在于其它RNA病毒中。本研究通过体外生物化学的方法证明,大肠杆菌表达的重组EAV nsp10Δ（氨基酸残基第1-402位）依然具有和全长蛋白一样的ATP水解酶和解旋酶的活力；同时解析了nsp10Δ单体及其与poly（dT）的复合物结构。EAV nsp10Δ主要由N端的ZBD、C端的解旋酶核心区域1A和2A（HEL1）以及连接两者的1B结构域构成。ZBD螯合三个锌离子,由RING-like模块和treble-clef锌指结构组成。结构和生化分析证明EAV nsp10对核酸的结合无序列依赖性,nsp10的酶活力依赖于ZBD和HEL1之间的相互作用网络。之前的研究中鉴定的一些ZBD位置上的突变,都是由于直接或间接地破坏了ZBD和HEL1之间的相互作用而使EAV nsp10的酶活力丧失。为了研究马动脉炎病毒属的解旋酶结构的保守性,本研究还解析了该属的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）的解旋酶nsp10的结构。比较两者的结构发现,动脉炎病毒解旋酶的三维结构非常保守。通过对比目前解析的SF1解旋酶发现,EAVnsp10和人解旋酶Upfl的结构最相似。Upfl在细胞中的一个主要功能是参与无意义介导的mRNA质量控制,鉴于尼多病毒的具有很大的复制酶阅读框ORF1ab （9.5kb-21kb）,本研究推测尼多病毒的解旋酶可能具有控制病毒mRNA质量的功能。综上所述,本论文的第二部分第一次解析了尼多病毒中一种主要的酶以及药物靶标（马动脉炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶nsp10）的三维结构。鉴于尼多病毒解旋酶序列的保守性,本研究解析的EAV nsp10和PRRSV nsp10的结构有利于将来研究其它尼多病毒（如冠状病毒）的解旋酶的结构和功能。EAV nsp10和Upfl的结构相似性将病毒和细胞解旋酶的研究联系起来,有助于理解这类重要的酶的进化和功能。