研究背景胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)包括宫内生长迟缓(IUGR)和低出生体重(LBW),是造成围产儿死亡和发病的重要原因之一。代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是以中心性肥胖、糖尿病或糖调节受损、高血压、血脂异常等多种代谢性疾病合并出现为临床特点的一组症候群。这些常见的慢性疾患严重影响了个人的生活质量。随着流行病学调查深入,发现低出生体重是成年后发生MS的高危因素。因而研究低出生体重引起成年后MS的机制,以及实施成年期疾病的早期防治已成为一个研究热点。出于医学伦理学的考虑,不能直接在人体上进行试验,因此必须制造合适的低出生体重动物模型用于实验研究。胎源假说、营养程序化和代谢程序化等理论的提出为孕期低蛋白饮食法建立低出生体重仔鼠模型提供了理论基础。胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)是MS发生的共同病理生理机制。在胰岛素的靶器官中,胰岛素抵抗最先在骨骼肌中表现出来,骨骼肌形态结构的异常也将影响其功能的发挥。胰岛素发挥代谢调节作用必须通过胰岛素受体底物蛋白激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3 kinase,PI3K)途径。该途径中任何环节出现异常都将引起胰岛素信号传导减弱或受阻,导致胰岛素抵抗形成,影响其调节糖代谢等生理效应的发挥。在低出生体重人群和动物中,有少数研究报道了某个年龄段的个别传导因子的变化情况,目前尚缺乏生长发育过程中PI3K信号传导途径中各重要因子的动态变化规律以及在胰岛素抵抗发生中的作用的研究。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)是肾素血管紧张素系统(RAS)的关键产物。大量的动物实验和临床研究已证实AngⅡ与胰岛素抵抗存在相关性,AngⅡ对胰岛素PI3K信号途径具有多位点的调节作用:抑制IRS-1的磷酸化、PI3K的激活、PKB的磷酸化以及GLUT4的转位等,导致胰岛素抵抗。有报道在低出生体重存在RAS活性的增强、AngⅡ含量增加。那么是否存在AngⅡ表达和作用的增强,从而抑制低出生体重的PI3K传导途径,形成外周胰岛素抵抗,削弱胰岛素的各种代谢调节作用呢?目前尚不清楚。营养素是基因表达的重要调节因子,它可通过控制代谢产物或代谢状态导致mRNA、蛋白质合成与功能改变。“营养程序化”概念指出,在发育的关键或敏感时期,营养状况将对机体或各器官功能产生长期、以至终生的影响。故可以补充营养素改变发育关键时期低出生体重人群或动物的营养状况来改变胰岛素靶器官的结构和功能,达到预防胰岛素抵抗、降低成年期MS的发生。精氨酸是一种条件必需氨基酸,在生物体内有生理作用的是左旋精氨酸(L-arginine,L-Arg),发挥着广泛而重要的生理和药理作用:可以治疗FGR、促进胎儿生长发育;能保护胰腺内分泌功能、改善外周胰岛素抵抗;能抑制心血管组织局部的RAS、减少AngⅡ含量等等。而在低出生体重补充L-Arg,是否可以通过抑制RAS活性、减低AngⅡ的含量和作用,从而改善胰岛素信号传导,减轻或防止发生胰岛素抵抗,达到预防成年期MS的目的呢?这一推测还有待证实。目的(1)本实验给予孕鼠10%低蛋白饮食,观察所生仔鼠数目、平均体重、IUGR发生率及围产期死亡率,并观察低出生体重仔鼠自幼年至成年期体重、血糖、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数等的变化。(2)在低出生体重仔鼠模型上观察发育不同时期骨骼肌的形态结构变化;研究生长发育过程中PI3K信号传导途径中重要因子的动态变化及在胰岛素抵抗发生中的作用。(3)观察低出生体重仔鼠发育过程中AngⅡ的表达和作用情况,并分析其与PI3K信号途径因子的变化关系,揭示低出生体重仔鼠发生胰岛素抵抗的机制。(4)在低出生体重仔鼠生命早期补充L-Arg,观察对仔鼠体重、血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数的影响,对骨骼肌形态结构的影响,以及对骨骼肌PI3K信号传导途径中重要因子表达和功能的影响。并分析L-Arg干预下AngⅡ的表达和作用变化,探讨L-Arg防治胰岛素抵抗的可能机制。方法(1)低出生体重仔鼠模型的建立和实验分组:采用健康三月龄SD二级雌性和雄性大鼠各18只。按照雌雄1:1的比例同一笼中交配,次日清晨检测出阴栓者定为受孕成功,按随机数字表法分配进入实验分组。孕期给予模型组、干预组孕鼠10%低蛋白饲料制造低出生体重仔鼠模型,给予正常组孕鼠21%正常蛋白饲料喂养。仔鼠生后21天的哺乳期内,给予正常组和模型组母鼠自由饮水,给予干预组母鼠富含L-Arg的饮用水喂养。哺乳期母鼠均给予正常蛋白饲料,断乳后仔鼠给予正常蛋白饲料喂养。分别测定7d,21d,2m,3m龄仔鼠体重、血糖、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数等。(2)骨骼肌形态结构、PI3K信号传导途径因子、AngⅡ的检测:留取7d、21d、2m龄正常组、模型组仔鼠骨骼肌标本进行病理学检查和透射电镜下超微结构分析;提取骨骼肌组织总蛋白,用Westernblot方法检测PI3K信号传导途径重要因子PI3K、PKB和胰岛素刺激前p-PKB、总GLUT4蛋白的表达;给予胰岛素刺激骨骼肌后,提取总蛋白,用Western blot方法检测p-PKB蛋白表达,提取细胞膜蛋白,用Western blot方法检测细胞膜GLUT4的蛋白表达;用放射免疫法检测骨骼肌中AngⅡ的浓度、免疫组织化学法检测骨骼肌中AT1R的表达。(3)L-Arg干预后相关指标的检测:于7d、21d、2m龄留取干预组仔鼠称体重、取血和骨骼肌标本。测定血糖、血清胰岛素值,计算胰岛素抵抗指数。骨骼肌标本进行病理学检查和透射电镜下超微结构分析;提取骨骼肌组织蛋白,用Western blot方法检测PI3K信号传导途径重要因子PI3K、PKB、p-PKB和总GLUT4蛋白的表达;给予胰岛素刺激后,分别提取骨骼肌总蛋白和细胞膜蛋白,用Westernblot方法分别检测p-PKB和细胞膜GLUT4的蛋白表达;用放射免疫法检测骨骼肌中AngⅡ的浓度、免疫组织化学法检测骨骼肌AT1R的表达。采用SPSS11.5统计软件进行数据统计分析。计量资料两组间均数比较采用t检验、多组间均数比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)的SNK检验或最小显著差异(LSD)检验。计数资料两样本比较用卡方检验,参数间相关性分析采用直线相关分析。以P＜0.05为差异具有显著性。结果(1)模型组、干预组仔鼠平均出生体重明显低于正常组(P=0.000,0.000),达IUGR标准,而每窝产仔数和围生期死亡率无明显差异(P=0.946,P=0.158)。(2)7d龄时,模型组、干预组仔鼠体重均低于正常组(P=0.000,0.000),但干预组高于模型组(P=0.029);21d龄时,干预组体重高于模型组(P=0.036),达正常水平(P=0.956);2m龄时,模型组、干预组仔鼠体重均明显低于正常组(P=0.001,0.044),干预组体重较模型组高,但差异无统计学意义;3m龄时,模型组与正常组体重比较无明显差异(P=0.097)。7d、21d、2m龄时,三组仔鼠血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数均无显著差别;3m龄时,模型组仔鼠血糖较正常组高,但尚无统计学意义(P=0.170)。(3)自7d至2m龄,模型组仔鼠骨骼肌纤维有明显萎缩、排列稀疏紊乱,干预组骨骼肌纤维排列较模型组整齐、紧密;2m龄时模型组仔鼠骨骼肌超微结构明显异常,肌原纤维排列紊乱、松散,部分萎缩、断裂,大部分线粒体肿胀、嵴断裂、空泡化。干预组肌原纤维排列较紧密,少部分线粒体出现肿胀、空泡化。(4)7d龄时干预组仔鼠骨骼肌PI3K的蛋白表达开始高于模型组(P=0.007),至21d龄时干预组已接近正常组(P=0.737),2m龄时模型组明显低于正常组(P=0.042),干预组与正常组、模型组比较均无显著差异(P=0.354,0.225);各时间点三组间仔鼠骨骼肌PKB的蛋白表达均未见显著差别(P＞0.05);7d时三组仔鼠骨骼肌胰岛素刺激前p-PKB的蛋白表达无明显差别(P＞0.05),21d、2m龄时模型组明显高于正常组(P=0.007,0.000)和干预组(P=0.003,0.000),而干预组与正常组比较无差异(P=0.703,0.711);给予胰岛素刺激后,7d龄干预组p-PKB上升幅度低于正常组(P=0.008)、高于模型组,但差异尚不显著(P=0.083),21d龄时干预组p-PKB上升幅度达到正常组水平(P=0.783),2m龄时干预组显著高于模型组(P=0.000),但低于正常组(P=0.001);三组仔鼠各时间点细胞总GLUT4的蛋白表达未见明显差异(P＞0.05),而经胰岛素刺激后干预组细胞膜GLUT4的蛋白表达在7d、21d、2m龄时均较模型组高(P=0.003,0.000,0.000),与正常组相当(P=0.124,0.179,0.761)。(5)各时间点干预组仔鼠骨骼肌AngⅡ浓度均较模型组明显减低(P=0.002,0.016,0.001),且与正常组比较无明显差异(P=0.100,0.542,0.685);干预组骨骼肌AT1R表达较模型组弱、接近正常组。相关性分析显示AngⅡ浓度与胰岛素刺激下p-PKB上升幅度、细胞膜GLUT4表达成负相关(P＜0.01,0.05)。结论(1)低出生体重仔鼠在2m至3m龄出现了生长追赶现象,2m龄内尚未出现胰岛素抵抗表现。(2)低出生体重仔鼠骨骼肌结构改变、PI3K信号传导途径异常,AngⅡ表达和作用增强,并可能抑制PI3K信号传导途径。(3)生命早期补充L-Arg可促进低出生体重仔鼠提早完成追赶生长,减轻骨骼肌病变,降低AngⅡ的表达和作用,改善PI3K信号传导途径。