目的:1、应用高敏度小张力膜状生物材料力学性能测定仪检测不同支架材料和不同成纤维细胞数量的组织工程真皮的抗张强度。2、研究体外分离、培养、冻存人脐静脉内皮细胞的有效方法以获得大量人脐静脉内皮细胞,探讨其为构建含血管的组织工程皮肤提供种子细胞的可能性。3、研究组织工程皮肤培养液中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的分泌情况。4、检测复方壳多糖组织工程真皮条件培养基促进脐静脉内皮细胞增殖的能力。方法:1、分别培养含有不同数量成纤维细胞的胶原凝胶和复方壳多糖真皮替代物,15天后检测抗张强度。2、新鲜脐带内灌注胶原酶消化,获得内皮细胞,用含20%胎牛血清的M199液进行培养。倒置显微镜观察细胞形态,结合Ⅷ因子免疫组化鉴定细胞来源。内皮细胞加入10%甘油的冻存液,分别置于液氮保存1周和4周,复苏后血球计数板计数,绘制生长曲线。3、收集不同时相的单层成纤维细胞培养液、胶原凝胶真皮替代物(胶原凝胶DE)、胶原凝胶皮肤替代物(胶原凝胶SE)、复方壳多糖真皮替代物(复方壳多糖DE)、复方壳多糖皮肤替代物(复方壳多糖SE)培养液样本,双抗体夹心ELISA法测定其中VEGF分泌量。4、配制4种不同条件培养基:含10%DMEM的无血清内皮细胞培养基、10%单层成纤维细胞培养液的无血清内皮细胞培养基、10%复方壳多糖组织工程真皮培养液的无血清内皮细胞培养基和20%复方壳多糖组织工程真皮培养液的无血清内皮细胞培养基,[~3H]-TdR掺入法测量其促进脐静脉内皮细胞增殖的能力。结果:1、组织工程真皮抗张强度随成纤维细胞数量增多而增强(p<0.01),复方壳多糖组织工程真皮的抗张强度高于胶原凝胶真皮(p<0.01)。2、脐静脉内灌注胶原酶法可获取高纯度的内皮细胞,与未冻存细胞相比,复苏的细胞活力保持在80%以上,复苏后生长曲线与未冻存细胞相似。3、成纤维细胞(FB)在三维培养时分泌的VEGF明显高于其单层培养时的分泌量,复方壳多糖组织工程皮肤VEGF的分泌量又高于胶原凝胶组织工程皮肤。大多数培养液中VEGF含量在48小时内增长最快。4、复方壳多糖