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研究背景及目的：已有众多研究表明,丝氨酸蛋白酶丝氨酸肽酶1(high temperature factor A-1,HTRA1)在子宫癌、内膜癌、肝癌及黑色素瘤等多种人类肿瘤中表达降低甚至丧失,因此HTRA1具有肿瘤抑制因子的作用。此外还有研究表明在高表达HTRA1的乳腺癌、子宫癌及胃癌患者中,化疗敏感性明显高于HTRA1低表达的患者。然而,在肿瘤恶性转化过程中,HTRA1表达下调的机制目前并不清楚,HTRA1在人类肿瘤发挥抑瘤作用的具体机制目前仍不清楚。本研究检测HTRA1在胃上皮癌细胞株和正常胃上皮细胞中表达水平的差异,并构建了四种稳定表达不同的HTRA1si RNA的正常胃上皮细胞株,同时构建了稳定过表达HTRA1基因的正常胃上皮细胞株。研究HTRA1基因对胃癌的增殖,迁移侵袭的影响。本研究的目的是：1)探讨HTRA1在正常胃上皮细胞和胃上皮癌细胞的表达情况及机制；2)HTRA1过表达和表达敲除胃上皮细胞株的构建与鉴定及细胞生物学特性的改变。方法：1.分析了六种胃上皮细胞株中HTRA1的表达情况,其中两种是永生化,非肿瘤性“正常”胃上皮细胞(HFI-145和GES-1),另外四种为胃癌细胞(BGC-823、 MKN-45、SGC-7901和MKN-28)。2.采用启动子区域DNA甲基化重亚硫酸盐测序法检测HTRA1基因的甲基化状态,并使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古柳菌素(TSA, tricho statin A)和DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨(decitabine)联合或者单独干预,观察其对HTRA1恢复表达的影响。3.构建四种稳定表达不同的HTRA1si RNA的正常胃上皮细胞株,同时构建了稳定过表达HTRA1基因的正常胃上皮细胞株。4.运用CCK-8法,检测稳定表达不同的HTRA1si RNA的正常胃上皮细胞株和过表达HTRA1基因的正常胃上皮细胞株细胞增殖率。并采用Transwell法检测细胞迁移/侵袭情况。结果1.免疫组化结果表明,HTRA1在远癌组织中高表达,但在胃癌组织中明显下调,而在癌旁组织中表达情况不一2.荧光实时定量PCR检测了BGC-823、MKN-45、SGC-7901和MKN-28等四种上皮源性胃癌细胞株和HFI-145、 GES-1两组正常胃粘膜上皮细胞株中HTRA1mRNA表达情况。结果表明HTRA1mRNA在正常胃粘膜上皮细胞株中的表达明显高于其在胃癌细胞株中的表达。Northern印迹分析进一步证实了HTRA1mRNA在正常胃粘膜上皮细胞株和胃癌细胞株中的表达差异。3. HTRA1表达调控位点主要位于启动子的-511至-423bp区域。这个区域共有14个CpG岛,这些CpG岛在四种胃癌细胞株中全部甲基化,而在HFI-145和GES-1正常胃上皮细胞株中则存在大量未甲基化的CpG岛。4. BGC-823, MKN-45细胞中HTRA1表达被组蛋白去乙酰化抑制,而不受DNA甲基化影响,而在SGC-7901和MKN-28细胞中HTRA1表达受抑制的主要原因是由于DNA甲基化。在SGC-7901细胞系中,DNA甲基化和组蛋白去乙酰化可以协同控制HTRA1基因表达。5.采用DNA克隆方法在胃癌BGC-823细胞系中过度表达HTRA1。然而,经过潮霉素筛选后,却没有过表达HTRA1的克隆子存活,这表明HTRA1过表达导致了BGC-823细胞死亡。随后重点构建了HTRA1过表达和表达敲除GES-1细胞株,采用Invitrogen公司Flp-In系统进行稳定表达细胞株构建,随后本研究重点构建了HTRA1过表达和表达敲除GES-1细胞株,首先利月Flp-In转染系统构建了包含单个重组位点的细胞系,随后用包含靶向HTRA1编码区的siRNA或者HTRA1编码区全长序列的载体转染细胞。经潮霉素筛选后,如果β-半乳糖苷酶表达被抑制,则表明阳性克隆子中含有表达载体。随后,采用免疫印迹方法对阳性克隆子进行鉴定和分析。6. HTRA1敲除细胞稀疏,直径小,但增殖速度更快,而GES-1/HTRA1过表达细胞直径大且增殖更慢。HTRA1敲除细胞GES-1/siRNA4迁移能力显著增强,而HTRA1过表达细胞迁移能力显著下降。结论1. HTRA1基因在正常组织及细胞中高表达,而在胃癌组织中低表达,提示HTRA1在胃癌中发挥着抑癌基因的作用。2.在4种胃癌细胞株中,均检测到HTRA1表达调控位点甲基化,而在正常细胞株中未检测到,提示甲基化可能是HTRA1基因表达异常的机制之一。3. HTRA1过表达可导致了BGC-823细胞死亡。正常细胞过表达HTRA1后,细胞直径大且增殖更慢,迁移能力显著下降。而]HTRA1敲除后,细胞直径小且增殖速度快,迁移能力显著增强,HTRA1可能在胃癌的发生,发展,转移过程中发挥着重要作用。可作为胃癌的诊断,治疗的靶点之一。