利用家蚕丝腺退化模型研究JNK途径和BmNep1基因

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家蚕是鳞翅目模式昆虫,也是具有重要影响的产业昆虫。丝腺是家蚕最具特色和经济价值的器官,在家蚕幼虫化蛹的变态过程中发生典型的程序性细胞死亡。可以将其作为一个变态发育模型,来研究和分析家蚕的信号途径或基因功能等。基于家蚕丝腺退化模型,本文运用RT-PCR、RACE、qRT-PCR、Western blotting、生化分离、免疫细胞化学和RNAi等技术手段,克隆了家蚕JNK途径几个相关基因,初步探讨了家蚕中该途径的功能,并克隆了家蚕中的新基因BmNep1,研究了它的表达与调控,初步分析了家蚕中该基因的功能。主要结果如下:1.克隆和鉴定了家蚕中的新基因BmJun、BmFos和BmNep1基于果蝇中DJun、DFos和推测的Nep1的氨基酸序列,本文发掘和克隆了家蚕BmJun、BmFos和BmNep1基因的cDNA序列。BmJun基因的最大ORF为720bp,编码239个氨基酸,预测分子量为26.8kD。BmFos基因的最大ORF为1143bp,编码380个氨基酸,预测分子量为41.6kD。BmJun和BmFos的C端均含有与果蝇DFos和DJun相同的BZIP典型功能结构域。BmNep1基因的最大ORF为711bp,编码236个氨基酸,预测分子量为~26.5kD;该基因含有3个外显子和2个内含子,定位于家蚕15号染色体;保守结构域分析显示推测的蛋白序列属于EMG1(Nep1)家族,该家族是40S核糖体生物发生所必需的;多序列比对和进化树分析表明Nep1在各物种中是一个高度保守的蛋白质。2.家蚕JNK途径参与丝腺退化过程果蝇中, DJun和DFos参与了变态期间唾液腺的退化调控。家蚕中JNK途径相关的BmJun、BmFos等重要基因仍没有被研究鉴定。本文利用BmJun的多克隆抗体,发现BmJun在BmN细胞的细胞核中集中出现,这与其作为转录因子的作用相符。在丝腺退化过程中,BmJun和BmFos在预蛹期的表达量达到相当高的水平,分别是5龄第7天的~328.7和~140.8倍。在丝腺各个部位的退化过程中,这2个基因均显著上调表达。BmJNK基因的转录水平在丝腺退化消亡过程中亦被上调。表达分析发现,BmJNK基因至少具有2个剪接体。BmJun总蛋白在预蛹期显著上调,与BmJun基因转录水平的变化一致。以上结果表明家蚕JNK途径参与了丝腺退化过程。3.家蚕JNK途径参与成虫眼睛和子代卵的发育调控果蝇中DJun参与成虫眼睛和卵发育的调控。我们利用混合siRNA在摇摆期(或吐丝早期)干扰BmJun基因的表达。实时定量结果表明,混合siRNA可以显著下调BmJun基因的转录水平。干扰BmJun基因的表达导致蛹期成虫眼睛发育异常,导致雌蛾产卵量下降,与正常卵相比,干扰组的卵小而褶皱。结果表明,家蚕JNK途径具有与果蝇中类似的功能。本文首次在家蚕中鉴定了JNK途径的生理功能,为家蚕信号通路的深入研究提供了线索。4.家蚕BmNep1基因参与变态期间组织的退化酵母中Nep1蛋白参与40S核糖体的生物发生,人类Nep1突变导致BCS疾病。目前为止在昆虫中仍无Nep1功能研究的相关报道。在家蚕丝蛋白大量合成的5龄幼虫期,直至化蛹变态的丝腺程序性细胞死亡过程中,丝腺中BmNep1基因的表达谱与其他核糖体生物发生相关基因BmP0,BmP1和BmP2不同。家蚕幼虫化蛹变态期间,丝腺中BmNep1基因的转录水平伴随丝腺的程序性细胞死亡所致的组织退化消亡过程显著上调。在中部和后部丝腺的退化过程中,BmNep1基因均被诱导表达。在摇摆期,几乎检测不到BmNep1蛋白,从吐丝期开始,BmNep1蛋白水平上调。在家蚕中肠退化和重塑过程中,与其他核糖体生物发生相关基因BmP1不同,BmNep1基因在吐丝期显著上调表达。在摇摆期,几乎检测不到BmNep1蛋白,从吐丝期开始,BmNep1蛋白水平上调。表明BmNep1基因参与了家蚕幼虫化蛹变态过程中组织的退化。干扰BmNep1基因的表达导致蚕变态异常。5.家蚕BmNep1基因的表达受蜕皮激素调控变态期间丝腺和中肠中BmNep1基因上调变化与蜕皮激素早期作用基因BmE74A的表达上调变化一致,即与血淋巴中蜕皮激素的滴度变化吻合。本实验利用生化分离和细胞免疫组化方法,将BmNep1蛋白质定位到家蚕BmN细胞核中。进一步以2μmol/L和4μmol/L的20E暴露BmN细胞,证明了蜕皮激素的活性形式20E可以促进BmNep1基因表达,并促进细胞核内BmNep1蛋白水平上升。本文首次观察到Nep1基因受内分泌激素调控,参与变态期间家蚕组织的退化过程,可能参与程序性细胞死亡的调控,这些研究对于Nep1功能的鉴定具有重要意义,对于深入理解昆虫发育变态和组织变化过程具有重要意义。这也为研究Nep1突变而导致的人类神经退行性疾病(BCS)分子机制提供了一种可能的探索方向。
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