论文部分内容阅读
背景脂多糖是脓毒症和脓毒症相关性肺纤维化的重要致病因素,对LPS诱导肺纤维化发病机制的深入研究始终是重症医学领域的重要研究方向,但其相关机制目前尚未阐明。本研究采用LPS诱导肺成纤维细胞自噬、肺纤维化模型深入研究Thy-1表达缺失、整合素β3表达上调对肺成纤维细胞自噬的保护作用及机制。方法1.第一部分:应用LPS刺激小鼠肺成纤维细胞,通过Western Blot技术检测Thy-1、整合素β3、自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达,透射电子显微镜检测自噬小体。2.第二部分:采用抑制剂和siRNA抑制整合素β3、siRNA或过表达慢病毒抑制或过表达Thy-1,Western Blot检测LPS刺激后细胞内Thy-1、整合素β3、PI3K-Akt-m TOR信号通路关键分子、自噬相关蛋白的表达,透射电子显微镜技术检测自噬小体。应用LPS多次打击的方法构建小鼠肺纤维化模型,肺组织切片行HE和Masson染色以及α-SMA的免疫组织化学染色;Western Blot检测肺组织Thy-1、整合素β3、LC3、P62和α-SMA蛋白表达;检测肺组织羟脯氨酸和I型胶原蛋白含量。经气管内注射Thy-1过表达腺相关病毒或腹腔内预注射整合素β3抑制剂西仑吉肽,继之按前述方法建立肺纤维化模型,比较以上各指标的变化情况。结果1.第一部分:LPS刺激后引起Thy-1表达下降、整合素β3表达增加、自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-II/I表达下降以及细胞内自噬小体数量减少。2.第二部分:细胞实验证实抑制整合素β3、过表达Thy-1均能逆转LPS诱导的PI3K-Akt-m TOR通路活化及自噬抑制;在LPS缺失的情况下,抑制Thy-1能模拟LPS刺激所诱导的PI3K-Akt-m TOR通路活化及自噬抑制的相关效应。动物实验证实LPS多次打击能引起小鼠肺纤维化,伴随着小鼠肺组织Thy-1表达下调、整合素β3表达增高和自噬抑制;经气管内注射Thy-1过表达AAV或腹腔内预注射剂西仑吉肽均能逆转LPS诱导的小鼠肺纤维化、Thy-1表达下调、整合素β3表达增高和自噬抑制过程。结论LPS能抑制肺成纤维细胞自噬并引起肺纤维化,LPS通过诱导Thy-1表达缺失和整合素β3表达上调而活化PI3K-Akt-m TOR通路,抑制肺成纤维细胞自噬并促进肺纤维化进程。