背景与目的最近二十年来法医物证学最引人注目的变革,就是DNA分析技术的应用及发展。对于高度降解检材和微量检材,如何从中获取可靠的、足量的遗传学信息,来进行法医学个体识别和亲权鉴定,一直是法医物证学面临的重大挑战。随着降解DNA分析技术的不断发展,如何评价、比较不同方法的检验效能的问题,逐渐引起法医学者的关注;要实施此类研究,首先需要制备出特定片段长度的降解DNA标准样品。迄今,已提出了几种降解DNA的人工制备方法,包括超声振荡、DNA酶消化以及其它理化措施(改变环境温度、湿度、自然放置等),但是,这些方法目前均未被广泛接受。因此,本文尝试探讨高度降解检材的人工制备方法。随着相关研究的不断深入,尽可能缩短靶DNA片段的扩增子长度,已经成为降解DNA分析的基本策略,目前mini-STR-PCR和mini-sequencing是其代表技术。但是,现有的mini-STR-PCR和mini-sequencing技术要求降解DNA片段的长度不得小于100bp～200bp。一旦基因组DNA发生了非常严重的降解,片段小于100bp的情况下,如何获得足量、可靠的遗传学信息来进行法医学鉴定呢?对此问题,目前尚无确切的解决方法。当前,对于微量检材或低拷贝数检材(low copy number,LCN)的DNA分析,主要有两种检测策略:一是增强PCR-STR分型法,主要是增加PCR反应循环次数,提高STR位点扩增成功率(检测信号多寡)和产物量(检测信号的强弱),而后进行DNA分析;二是首先进行LCN检材的全基因组扩增或者巢式PCR扩增,以获取足量的DNA模板,而后进行DNA分型。但是,由于LCN检材所含DNA模板量过少,受随机效应的影响,采用上述两种策略,均会出现“额外”等位基因、影子带(stutter带)、等位基因丢失等一些难以避免的问题,STR分型结果通常具有不可重复性,并难以评价其有效性,无法得到可靠的法医学鉴定结论。近年来,基于连接酶检测反应(LDR)的SNPs分型技术快速发展,为降解检材和微量检材的法医学DNA分析提供了新的契机。首先,LDR探针与模板DNA互补结合的序列不需过长,只要满足以下两个条件即可:(1)能够有效识别待测靶位点,(2)不影响连接酶的识别与结合所需片段长度,所以,LDR探针长度不超过数十个碱基。再者,对于双链DNA的单链切口,DNA连接酶的识别与连接反应具有高度严谨性。因此,从理论上说,只要DNA片段不小于30～50bp,即可采用LDR技术进行SNP分型检测,这一特性尤其适用于高度降解DNA分析。所以,本文尝试LDR-PCR策略来检测高度降解DNA。再者,锁式探针(padlock probes)可识别靶位点并形成包含单链切口的局部双螺旋结构,经LDR反应可生成环状模板,LDR反应的高度严谨性保证了等位基因识别的准确性;同时,超分支滚环扩增反应具有极强的扩增效能,可极大地放大LDR检测信号。将二者结合起来,对LCN检材的分析效能将得以极大提高。所以,本文拟开发LDR-HRCA策略来检测LCN检材。材料与方法枸橼酸钠抗凝人末梢静脉血样品12份,男女各6份,由中国医科大学法医学院法医血清学教研室提供。采用酚—氯仿法提取基因组DNA。分别使用超声法和DNaseⅠ酶切法处理高分子量基因组DNA,于不同时间段取样,电泳和/或PCR扩增检测DNA片段长度,人工制备不超过100bp的高度降解DNA检材。使用AmpFl STR(?)Identifiler(?)PCR Amplification Kit对降解DNA检材进行复合STR分型检验。选择4个待测SNPs位点(rs17750303、rs2307647、rs2307557和rs17250992),并构建各位点的LDR探针:首先采用LDR反应,识别降解检材各待测位点的基因型;而后采用PCR反应,扩增连接后LDR探针,根据PCR产物电泳结果判断各位点基因型。使用稀释法制备DNA浓度梯度样品:200、100、50、40、30、20、10pg/μl。使用AmpFl STR(?)Identifiler(?)PCR Amplification Kit对微量检材进行复合STR分型检验。选择rs17750303位点,并构建一对等位基因特异性锁式探针(CPP和APP);首先采用LDR反应,识别待测位点的基因型;而后采用HRCA反应,扩增环化锁式探针,根据电泳结果判断各位点基因型。结果1、超声法处理基因组DNA,可重复性不佳,DNA片段分布范围表现出明显差异。随着DNaseⅠ酶切时间延长,DNA片段长度不断缩短;酶切150min,降解DNA片段长度不超过100bp。2、对于片段长度不超过100bp的人工降解DNA样品,AmpFl STR(?)Identifiler(?)PCR Amplification Kit中全部STR基因座均不能识别。采用LDR-PCR方法,进行单位点检测,单碱基置换变异(rs17750303和rs17250992)和三碱基缺失/插入变异(rs2307647和rs2307557)均能得到正确分型结果,多态性碱基的变异类型不是LDR反应忠实性的主要影响因素;短LDR探针(rs17750303和rs2307647)与长探针(rs2307557和rs17250992)均可得到准确分型结果,探针特异性互补序列可短至10个核苷酸而不影响LDR反应。进行2位点及4位点复合检测,均可获得准确分型结果,可有效避免探针间交互效应。3、使用AmpFl STR(?)Identifiler(?)PCR Amplification Kit,PCR循环数34次,DNA模板量≥100ng,全部STR基因座均能正确识别;DNA模板量≤50ng,等位基因丢失现象严重,长扩增子座位尤为显著。采用LDR-HRCA方法检测rs17750303纯合型样品(CC型、AA型),产物量随DNA模板量降低而减少,20pg以上可获得正确的基因分型结果;CC纯合型样品10pg组共10份,CC表型7份,AC表型2份,无产物1份;AA纯合型样品10pg组共10份,AA表型6份,AC表型1份,CC表型1份,无产物2份。检测rs17750303杂合型样品(AC型),产物量随DNA模板量降低而减少,30 pg以上可获得正确的基因分型结果;10pg组共10份,AC表型6份,CC表型1份,AA表型2份,无产物1份。所有样品的检验过程中,均未发现影子带现象。结论1、采用DNaseⅠ酶切法处理基因组DNA,操作简单,DNA降解程度易于控制,结果稳定,可用于制备特定片段长度的降解DNA标准样品。2、对于片段长度小于100bp的高度降解DNA检材,LDR-PCR方法可准确进行SNPs基因座分型,并可进行4个基因座复合分型检测。本方法对于高度降解检材的法医学DNA分析,具有较大的开发价值。3、对于LCN检材,LDR-HRCA方法检测特异性好,灵敏度高于增强PCR-STR技术,可能更适用于法医学微量DNA分析。4、本研究总结的待测SNPs位点筛选及相应LDR探针构建原则,可保证高度降解检材和微量检材SNPs分型的特异性和灵敏性,并且能够满足高通量检测的要求。