TGF-β1诱导的CK17对宫颈癌细胞干性特性的调控

来源 :南方医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:llt009
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研究背景和目的尽管传统疗法对肿瘤初始有效,但是肿瘤的复发和转移依然是肿瘤患者治疗失败的两大原因。研究表明,传统疗法能杀灭肿瘤组织中大部分分化和增殖的癌细胞。然而,剩下一小部分,因其具有无限自我更新、抵抗放化疗和致瘤性等能力,甚至有些在肿瘤早期就能到达远处转移的癌细胞,成功地逃过传统疗法的法眼。这强大的亚细胞群,被称为"肿瘤干细胞"。该群细胞与正常干细胞相似,通常出于静止期而不受细胞分裂活动影响,被认为是肿瘤发生、发展、复发和转移的根源。对于宫颈癌患者来说,早期的宫颈癌患者在手术切除和放化疗等手段下,治愈率可达到80-90%;而晚期的宫颈癌患者,因有局部侵袭或远处转移,即使在传统疗法综合治疗的情况下,5年生存率依然很低。因此,寻找靶向杀灭宫颈癌干细胞的治疗方案,或辅以传统疗法的综合治疗方案,对治疗晚期宫颈癌患者来说,具有重要意义。目前,在宫颈癌的国内外研究中,尚没有统一公认的宫颈癌干细胞标志物,仅有个别对宫颈癌干细胞标志物的报道。除此之外,信号转导分子和微环境组成干细胞分化和自身更新动态平衡的壁龛(niche),这些信号分子在激活细胞功能、调控细胞分化以及控制细胞分裂方面起着关键作用,打破其平衡状态将导致细胞失控性增长及肿瘤发生。深入研究和理解宫颈癌干细胞标志物及其自身更新、多向分化调控中信号通路蛋白组成的复杂网络系统,对发展针对宫颈癌干细胞的靶向治疗至关重要。HPV导致宫颈癌是常见感染的偶发事件,正常妇女从HPV感染到宫颈癌发生是一个量变到质变的过程。高危型HPV持续感染提供了有利于宫颈上皮恶性转化的慢性炎症微环境,是宫颈癌发生的必要条件。最新研究表明,肿瘤微环境与肿瘤干细胞有着密切的关系。炎症微环境能够招募髓系间充质干细胞,其与肿瘤细胞的融合可以导致细胞基因的重编码而形成肿瘤干细胞;炎症微环境中的免疫细胞,能够通过分泌细胞因子,刺激肿瘤细胞中的干性通路,从而导致非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞的转化。而HPV相关的宫颈癌肿瘤微环境中最重要的细胞因子之一为转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)。近年来,学者发现TGF-β1除了有促进EMT发生的作用之外,还可以诱导肿瘤干细胞的产生。而在宫颈癌的研究中,尚未有人报道过TGF-β1与宫颈癌干性特性的关系,因此TGF-β1在宫颈癌干性转化和转移中所起的作用引起我们的巨大兴趣。本课题利用TGF-β1来刺激宫颈癌细胞株SiHa,探讨其对宫颈癌细胞干性特性的影响,从而筛选出与TGF-β1相关的宫颈癌特异的肿瘤干细胞标志物CK17,并研究TGF-β1调控CK17表达的相关分子信号通路,最后在宫颈癌组织中进一步检测其表达情况及验证TGF-β1与CK17相关性。本课题旨在阐述TGF-β1诱导CK17调控宫颈癌细胞干性转化的相关分子机制,为晚期宫颈癌的治疗——宫颈癌干细胞的靶向治疗提供了新的靶点和相关通路。研究方法1.TGF-β1对宫颈癌细胞干性特性的影响及靶点筛选和验证1.1利用TGF-β1(1Ong/ml)连续刺激宫颈癌细胞株,成球实验和侧群细胞检测对照组和TGF-β1处理组各自肿瘤球数目和侧群细胞的比例。1.2实时荧光定量PCR检测TGF-β1处理组和对照组的宫颈癌可能干细胞标志物(NANOG,NSETIN,SOX2,OCT4,CK17,ALDH1,CD133)的 mRNA表达水平的变化。1.3利用小干扰片段RNA干扰CK17的表达,成球实验和侧群细胞检测干扰了 CK17的表达后对TGF-β1促宫颈癌细胞系干性特性增加的影响。2.CK17与TGF-β1诱导的上皮间质转化的关系2.1利用倒置显微镜观察TGF-β1作用下细胞形态学变化,蛋白免疫印迹法和免疫荧光检测对照组和TGF-β1处理组EMT相关指标(Ecadherin,Fibronectin,Vimentin)O2.2利用蛋白免疫印迹法检测siRNA干扰CK17的表达后对TGF-β1促EMT的指标的影响。3.TGF-β1上调CK17表达的相关通路研究及验证3.1利用蛋白免疫印迹法检测TGF-β1刺激的不同时间点的TGF-β1主要和非主要信号通路的相关蛋白的表达情况,包括p-Smad3和Smad3,p-ERK1/2和ERK1/2,p-p38 和 p38,p-JNK 和 JNK,p-PI3K 和 PI3K 等指标。3.2利用Smad3磷酸化的抑制剂SIS3,ERK1/2磷酸化的抑制剂U0126和JNK磷酸化的抑制剂SP600125预处理SiHa细胞后再加用TGF-β1刺激。利用蛋白免疫印迹法和双荧光素酶系统检测相关通路抑制后CK17的蛋白表达水平和CK17基因启动子荧光活性的变化。3.3构建CK17基因启动子的截短子,利用双荧光素酶报告系统检测对照组和TGF-β1处理组荧光活性差异最明显的片段,筛选TGF-β1作用于CK17启动子的靶点。3.4利用生物信息学在线网站TFSEARCH和CONSITE预测结合于CK17基因启动子片段(-661~-183)之间的转录因子;在SiHa和293T细胞中转染相关载体,利用双荧光素酶报告系统验证预测转录因子与CK17基因启动子的关系。3.5利用ERK1/2磷酸化的抑制剂U0126预处理SiHa细胞后再加用TGF-β1刺激。实时荧光定量PCR检测对照组,TGF-β1处理组,U0126组,U0126+ TGF-β1组的E2F4、MZF1和E2F1的mRNA表达水平。3.6利用siRNA沉默E2F4的表达后,荧光定量PCR比较nc组、nc+ TGF-β1组、siE2F4组和siE2F4+ TGF-β1组的CK17的mRNA表达的不同。4.TGF-β1和CK17在宫颈癌组织中的表达情况及其相关性采用免疫组化方法检测组织芯片中70例宫颈鳞癌(squamous carcinoma of the cervix,SCC)患者的 TGF-β1 和 CK17 的表达。研究结果1.TGF-β1对宫颈癌细胞干性特性的影响及靶点筛选和验证1.1成球实验显示对照组的肿瘤球数是35.33±2.52个/1000个细胞,而TGF-β1处理组的肿瘤球数是53.33±3.51个/1000个细胞,与对照组相比,TGF-β1处理组的成球能力显著性增强(P=0.002),肿瘤球体积增大,变得更圆;侧群细胞的检测显示TGF-β1处理组的侧群细胞比例增加,对照组的SP细胞比例只有0.5%,而TGF-β1处理组的SP细胞比例是1.9%,该变化有统计学差异(P<0.001)。1.2荧光定量PCR显示在TGF-β1刺激下,在TGF-β1刺激下,OCT4、SOX2、CK17 和 CD133 上调且具有统计学差异(OCT4=1.730±0.155,SOX2=1.321±0.079,CD133=3.563±0.954,CK17=7.367±0.949,P均<0.05),其中 CK17 的上调最高(P<0.001);其他宫颈癌可能干细胞标志物NANOG和NESTIN较Contro1组明显下调(NANOG=0.457±0.080,NESTIN=0.079±0.007,P值均<0.05),ALDH1无明显差异变化。1.3 siRNA干扰CK17的表达后抑制了 TGF-β1促宫颈癌干性特性的增强,siCK17+TGF-β1处理组与nc+TGF-β1组相比,其肿瘤球数下降(P=0.002),侧群细胞减少(P<0.05)。2.CK17与TGF-β1诱导的上皮间质转化的关系2.1 TGF-β1作用后,SiHa细胞形态发生了变化。梭形的SiHa细胞在TGF-β1的刺激下变得更细长,细胞排列变得有序。蛋白免疫印迹法和免疫荧光检测示上皮细胞标志物Ecadherin表达下降,间质细胞标志物Fibronectin和Vimentin表达升高。2.2 siRNA干扰CK17的表达后不影响TGF-β1促EMT的表型。结果显示,当干扰了 CK17的表达后,TGF-β1的上调Fibronectin和Vimentin的幅度未见明显抑制,下调的Ecadherin未见明显上升趋势;两组之间的指标无明显变化。3.TGF-β1上调CK17表达的相关通路研究及验证3.1随着TGF-β1刺激时间的延长,p-JNK在TGF-β1刺激15min后表达上调,而p-Smad3和p-ERK1/2均在TGF-β1刺激30min后表达上调,总的JNK、Smad3和ERK1/2表达未见明显变化。其他指标在TGF-β1刺激4小时内未见明显变化。3.2 U0126抑制ERK1/2磷酸化,TGF-β1上调CK17的作用受到抑制,而SIS3和SP600125抑制Smad3和JNK的磷酸化并不影响TGF-β1上调CK17的表达的作用。当pGL3-CK17-promoter通过转染的方法导入SiHa细胞,CK17组,TGF-β1 组,U0126 组,SIS3 组,SP600125 组分别均与 Vehicle Ctl 组的荧光活性强,且有统计学差异(F=39.194,P<0.001)。TGF-β1组的荧光活性是CK17组的近2.8倍,有显著统计学意义(P<0.001);当使用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126预处理2h(U0126组),我们发现TGF-β1上调CK17的受到抑制,U0126组与CK17组相比荧光活性无差异(P=0.422)。而使用Smad3磷酸化抑制剂SIS3或JNK磷酸化抑制剂SP600125预处理SiHa细胞与TGF-β1组比较无统计学差异(PSIS3vs.CK17=0.604,PsP600125vs.CK17=0.114),两者均不影响 TGF-β1 上调 CK17启动子转录活性的作用。3.3双荧光素酶报告系统检测发现pGL3-CK17-661及其以上较长片段的截短子在TGF-β1刺激下,其荧光活性明显比对照组增强,且有统计学差异(P均<0.05);而启动子截短子pGL3-CK17-34,pGL3-CK17-183的荧光活性在对照组和 TGF-β1 处理组中无明显差异(TpGL3-CK17-34=0.53 8,PpGL3-CK17-34=0.619;T pGL3-CK17-183=-0.854,P pGL3-CK17-183:=0.441)O3.4生物信息学在线网站TFSEARCH和CONSITE预测了 CREB,E2F1,E2F4,Snail,SP1等分值较高的6个转录因子。双荧光素酶报告系统结果显示E2F1下调CK17启动子活性,而MZF1和E2F4上调CK17启动子的荧光活性,其中,E2F4的促进作用最显著。3.5 TGF-β1能明显上调E2F4和MZF1的表达(P<0.05),当加了 U0126后,TGF-β1上调E2F4的作用明显受到抑制(P<0.001),且与Control组、U0126组对比无明显差异(Pcontrol vs.U0126+TGF-β1=0.071;PU0126vs.U0126+TGF-ββ1=0.071);而加了U0126抑制剂后MZF1的表达有一定下降,但较E2F4的下降程度低,且U0126+TGF-β1组与TGF-β1组无统计学差异(PTGF-β1vs.U0126+TGF-β1=0.211);对E2F1来说,TGF-β1对其有一定的抑制作用,虽有统计学差异,但其变化较小。3.6小干扰片段RNA干扰E2F4的表达后,荧光定量PCR结果显示TGF-β1上调CK17 mRNA表达的作用受到明显抑制(P<0.05)。4.TGF-β1和CK17在宫颈癌组织中的表达情况及其相关性TGF-β1和CK17的蛋白表达水平有显著的正相关关系(r=0.441,P<0.001),且两者的高表达与临床分期,淋巴结转移有明显相关性(PTGF-β1<0.001,PCK17=0.001),与年龄、病理分期等无明显相关性(P>0.05)。利用logistic回归分析发现,TGF-β1和CK17共同高表达更能预测宫颈癌的淋巴结转移。结论1.TGF-β1可以促进宫颈癌细胞株SiHa细胞干性特性的增加,而CK17在TGF-β1促宫颈癌细胞系干性特性增加的作用通路中起着关键作用。但是CK17与TGF-β1诱导的EMT无明显关系。CK17极可能是独立于TGF-β1诱导上皮间质转化作用的靶点。2.TGF-β1通过磷酸化激活ERK1/2信号通路上调转录因子E2F4的表达,上调的E2F4从而上调CK17的转录激活。3.在宫颈癌组织中,TGF-β1的表达与CK17的表达呈正相关关系,且两者均与宫颈癌的恶性程度和淋巴结转移密切相关,而CK17作为宫颈癌干细胞的标志物,TGF-β1的高表达辅以CK17的高表达则更能预测宫颈癌的淋巴结转移说明了 TGF-β1诱导CK17的表达促进宫颈癌干性转化,从而影响宫颈癌的转移。本项目的创新之处1.从机制上证实CK17是宫颈癌干细胞的主要标志物之一;2.揭示TGF-β1通过激活ERK1/2磷酸化上调转录因子E2F4的表达,从而上调CK17的表达参与宫颈癌细胞干性转化的新机制,为晚期宫颈癌的治疗——宫颈癌干细胞的靶向治疗提供了新的靶点和相关通路。
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