蜡梅转录因子CpBBX19基因的克隆及参与耐盐、抗旱调控的功能分析

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蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科(Calycanthaecae)蜡梅属(Chimonanthus Lindl.)的落叶灌木或小乔木,是我国独特的传统观赏花木,蜡梅花香宜人,花色素雅,观赏价值高。近年来,蜡梅产业开始蓬勃发展,常被作为盆景、庭院绿化和切花等,有着非常高的市场潜力和经济价值。蜡梅的分布范围很广,根系发达,对非生物胁迫具有较强的抗逆性。BBX基因编码蛋白属于锌指蛋白转录因子家族,主要参与植物的光形态建成、避荫性、开花以及生物和非生物胁迫等多个过程,对蜡梅BBX基因的克隆与功能分析,有利于为蜡梅抗逆形成的转录调节机理提供新的理论依据。本文克隆获得蜡梅转录因子Cp BBX19基因,并分析该基因的表达特性;通过异源转化拟南芥,研究Cp BBX19在非生物胁迫中的功能,初步明确Cp BBX19基因参与蜡梅抗逆调控的分子机制。主要研究结果如下:1.Cp BBX19的克隆及分子特性从蜡梅转录组数据库筛选出基因序列,设计特异性引物,通过PCR技术扩增出具有完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)的蜡梅Cp BBX19的全长c DNA序列,该序列包含475 bp的5’-UTR区(5’-untranslated region)、428 bp的3’-UTR(3’-untranslated region)和633 bp的编码序列(Coding Sequence,CDS);该CDS共编码210个氨基酸。通过构建Cp BBX19系统进化树,并将蜡梅Cp BBX19编码的蛋白与其他物种的BBX蛋白进行同源比对,结果表明Cp BBX19属于第Ⅳ亚家族,且与枣树的锌指蛋白BBX19(Ziziphus jujuba,XP_015892301.1)的亲缘关系最近。通过在线软件的分析,推测Cp BBX19蛋白是一个不稳定的亲水蛋白,预测它的分子式为C992H1590N304O316S20,不具信号肽结构,也无跨膜结构域,Cp BBX19蛋白二级结构主要由随机卷曲(Random coil,57.14%),α螺旋(Alpha helix,22.38%)和少量的延伸链(extend strand,17.62%)组成。2.Cp BBX19基因在蜡梅中的表达特性利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析Cp BBX19基因在蜡梅不同组织、不同开花阶段花芽以及在不同胁迫和激素处理下(干旱、高盐、高温、低温、ABA和Me JA)的表达特性。结果表明Cp BBX19基因在所检测的组织中均有表达,在子叶、幼叶以及花内瓣中表达量最高;在花发育过程中,Cp BBX19基因在初开早期时表达量最高,其次是初开晚期和盛花期;在不同非生物胁迫(干旱、高盐、高温、低温等)以及不同激素(ABA、Me JA)处理下,Cp BBX19基因都可以被诱导表达,但不同胁迫条件下,其表达量峰值的时间点有所不同。结果表明Cp BBX19基因响应干旱、高盐、高温、低温等非生物胁迫,并参与了ABA、Me JA的信号转导。3.Cp BBX19基因转拟南芥的胁迫耐性分析构建植物表达载体p GWB-551-Cp BBX19,并利用花序侵染法将该基因异源转化到拟南芥中,经过多次抗生素筛选得到纯合的T3代转基因拟南芥,选择表达量高,中,低的三个株系进行功能验证。胁迫耐性分析表明,Cp BBX19在拟南芥中异源表达可增强拟南芥对高盐和干旱的耐受性。并且胁迫处理后转基因拟南芥中的电导率和丙二醛(MDA)浓度显著低于野生型(WT)植株;此外,在盐和干旱的胁迫下,Cp BBX19过表达株系中参与胁迫应答的关键基因At COR15a、At KIN1、At LEA76和At RD29b基因的表达显著上调;当幼苗处于正常条件下或在盐和干旱胁迫条件下,转基因株系中的三个胁迫相关基因(At ABF1、At RAB18和At RD29a)也都显著上调,由此推测,Cp BBX19可在非生物胁迫的刺激下激活抗逆相关关键基因的表达,进而参与植物对非生物胁迫耐受性的调控。
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